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MyD88基因

Posted at — Aug 12, 2021

1.MyD88基因的靶向破坏导致il -1和il -18介导的功能丧失

抽象的

MyD88 最初是作为髓样分化初级反应基因分离出来的,通过与 IL-1 受体复合物和 IL-1 受体相关激酶 (IRAK) 相互作用,显示出在白细胞介素 1 (IL-1) 信号传导中充当适配器. 通过基因靶向缺乏 MyD88 产生的小鼠在 T 细胞增殖以及诱导急性期蛋白和细胞因子以响应 IL-1 方面存在缺陷。 IL-18 引起的干扰素-γ 产量和自然杀伤细胞活性的增加被取消。 体内 Th1 反应也受损。 此外,IL-18 诱导的 NF-κB 和 c-Jun N 端激酶 (JNK) 激活在 MyD88 被阻断 -/- Th1 发育细胞中 。 综上所述,这些结果表明 MyD88 是由 IL-1 受体和 IL-18 受体介导的信号级联反应的关键成分。

Abstract

MyD88, originally isolated as a myeloid differentiation primary response gene, is shown to act as an adaptor in interleukin-1 (IL-1) signaling by interacting with both the IL-1 receptor complex and IL-1 receptor–associated kinase (IRAK). Mice generated by gene targeting to lack MyD88 have defects in T cell proliferation as well as induction of acute phase proteins and cytokines in response to IL-1. Increases in interferon-γ production and natural killer cell activity in response to IL-18 are abrogated. In vivo Th1 response is also impaired. Furthermore, IL-18-induced activation of NF-κB and c-Jun N-terminal kinase (JNK) is blocked in MyD88−/− Th1-developing cells. Taken together, these results demonstrate that MyD88 is a critical component in the signaling cascade that is mediated by IL-1 receptor as well as IL-18 receptor.

介绍

白细胞介素-1 (IL-1) 是一种参与局部和全身炎症反应的促炎细胞因子(由 7 , 8 )。 IL-1 诱导多种炎症蛋白,如急性期蛋白、细胞因子和粘附分子,其基因主要受 NF-κB 和/或 AP-1 调控(综述由 7 , 8 )。 IL-1 信号由形成由 IL-1、IL-1 受体 (IL-1R) 和 IL-1R 辅助蛋白 (IL-1R-AcP) 组成的高亲和力复合物启动。 随后将 IL-1 受体相关激酶 (IRAK) 募集到受体复合物中。 12 , 5 , 17 , 19 , 47 )。 然后,IRAK 离开受体复合物并与 TRAF6 相互作用,最终导致 NF-κB 激活。 6 )。 IL-18 最初被确定为干扰素-γ (IFNγ) 诱导因子,可促进 IFNγ 的产生并增强自然杀伤细胞的活性。 35 , 36 )。 IL-18 与 IL-12 协同诱导 T 细胞产生 IFNγ,并在 Th1 反应中发挥重要作用。 38 , 42 )。 尽管功能相似,但 IL-18 在结构上与 IL-12 无关。 IL-18 与 IL-1 具有结构相似性( 2 )。 IL-18 作为无活性前体合成,需要被 IL-1β 转化酶 (ICE)/半胱天冬酶 1 裂解才能成熟,就像 IL-1β 的情况一样。 11 , 14 )。 IL-18 还激活 IRAK 和 NF-κB( 26 , 38 )。 Toll 蛋白决定了 背腹极性, 黑腹果蝇 胚胎的 并且还参与了抗真菌免疫反应。 16 , 31 , 32 , 20 )。 Toll 的胞质结构域与 IL-1R 的胞质结构域同源( 10 )。 通过 Toll 果蝇 中 的信号通路与哺乳动物中由 IL-1R 诱导的信号通路显示出惊人的结构和功能相似性。 46 , 3 )。 Toll 激活转录因子 Dorsal,它 的 果蝇 在与其配体 Spatzle 结合后 是 NF-κB 同源物。 31 , 32 )。 Toll 产生的细胞内信号的转导需要称为 Tube 的接头分子,用于将 Toll 与 Pelle 蛋白激酶 的 果蝇 (IRAK 同系物)结合起来。 21 , 40 , 13 , 9 , 34 )。 直到最近,还没有发现 Tube 的哺乳动物同源物。 MyD88 最初是作为骨髓分化初级反应基因分离出来的,在 M1 骨髓白血病细胞中,该基因在 IL-6 刺激下迅速分化为巨噬细胞。 22 )。 这种立即-早期激活谱表明 MyD88 在骨髓分化的调节进程中起作用。 随后发现 MyD88 与 IL-1R 家族有关,尤其是 Toll( 18 , 15 , 4 )。 与 IL-1R 家族不同,MyD88 不包含跨膜部分。 死亡域存在于其 N 端。 该蛋白质的 C 端结构域与 IL-1R 家族的细胞质片段高度同源。 最近,MyD88 被克隆为一种衔接分子,在 IL-1 刺激后将 IRAK 募集到 IL-1R 复合物并激活 NF-κB。 33 , 48 )。 MyD88 因此是 Tube 的功能同源物,尽管这两个分子在结构上没有关系。 为了了解 MyD88 在 IL-1 和 IL-18 信号传导中的体内功能作用,我们已经生成了 MyD88 缺陷小鼠。 在 MyD88 缺陷小鼠中,所有检查的 IL-1 和 IL-18 介导的功能均受损,表明 MyD88 是对 IL-1 和 IL-18 介导的信号传导至关重要的功能分子。

结果与讨论

MyD88 缺陷小鼠的生成

小鼠 MyD88 基因在 E14.1 胚胎干 (ES) 细胞中被同源重组破坏。 设计了靶向载体以用新霉素抗性基因替换编码 MyD88 C 端部分的两个外显子( 图 1A )。 这个区域 MyD88 基因的 与 IL-1R 的细胞质结构域显示出高度相似性。 人 IL-1R 中的相应区域包括对其信号传导至关重要的残基( 18 , 15 , 4 )。 在对 G418 和更昔洛韦双重耐药的 176 个 ES 细胞克隆中,有 33 个实现了同源重组。 将三个靶向 ES 细胞克隆显微注射到 C57BL/6 囊胚中,其中两个成功地将破坏的 传递 MyD88 基因通过种系 ( 图 1B )。 MyD88 缺陷型 (MyD88 -/- ) 小鼠以预期的孟德尔比率 (+/+: +/-: -/- = 52: 93: 53) 出生。 小鼠生长健康,直到 20 周龄才显示出明显的异常。 我们进行了 Northern 印迹分析以确认突变导致 失活 MyD88 基因 。 在 MyD88 的肝脏和脾脏中无法检测到 MyD88 mRNA -/- 小鼠 ( 图 1C )。 胸腺、脾脏和淋巴结中 CD3、B220、CD4 和 CD8 表达的流式细胞术分析表明, MyD88 淋巴细胞组成没有改变 -/- 与野生型小鼠相比, 小鼠的 (数据未显示)。 图 1 小鼠 靶向破坏 MyD88 基因的

MyD88 IL-1 介导的功能受损 -/- 小鼠中

我们首先检查了小鼠中 IL-1 介导的反应。 IL-1 被证明是 T 细胞生长的共刺激剂( 24 , 7 , 41 )。 MyD88 胸腺细胞 -/- 小鼠及其野生型同窝小鼠的 与IL-1β 和几种刺激物一起培养。 在野生型小鼠中,当与植物血凝素 (PHA)、伴刀豆球蛋白 A (ConA) 或低浓度 IL-2 在 IL-1β 存在下培养时,胸腺细胞显示出增强的增殖。 然而,MyD88 -/- 胸腺细胞对IL-1β 的反应没有表现出任何增强的增殖( 图2 )。 类似地,来自MyD88 脾细胞 -/- 小鼠的 没有响应IL-1β而增殖(数据未显示)。 来自野生型和 MyD88 胸腺 -/- 小鼠的 细胞对 IL-2 加佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸 PMA 或 IL-2 加 ConA 表现出几乎相等的增殖反应,表明 IL-1 介导的生长信号在来自 MyD88 淋巴细胞 -/- 小鼠的 ( 图 2 )。
图 2 MyD88 IL-1 介导的 T 细胞增殖受损 -/- 小鼠中

IL-1 还显示诱导产生急性期蛋白和炎性细胞因子,如 TNF-α 和 IL-6。 我们接下来分析了 MyD88 缺乏对这些功能的影响。 小鼠静脉注射 1 μg IL-1β,2 小时后取肝脏和血清。 从肝脏中提取总 RNA 并进行 Northern 印迹分析以检测血清淀粉样蛋白 A (SAA-I)、血清淀粉样蛋白 P (SAP) 和结合珠蛋白 (HP) 的表达。 在野生型小鼠中,注射 IL-1β 后,SAA-I、SAP 和 HP 的 mRNA 表达显着增加( 图 3A )。 然而,在MyD88 未观察到IL-1诱导的SAA-1、SAP或HP的mRNA表达增加 -/- 小鼠中 。 TNF-α 和 IL-6 的血清浓度通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测量。 在野生型小鼠中注射 IL-1β 后,血清 TNF-α 和 IL-6 浓度显着增加( 图 3B )。 相反,在MyD88 IL-1β处理后血清TNF-α和IL-6水平均未升高 -/- 小鼠中 。 因此,IL-1 介导的主要生物学功能在 MyD88 中严重受损 -/- 小鼠 。 图 3 MyD88 IL-1 诱导的急性期蛋白表达受损和炎性细胞因子的产生 -/- 小鼠中

MyD88 IL-18 介导的功能受损 -/- 小鼠中

IL-18 最初被确定为 IFNγ 诱导因子,与 IL-1 具有结构相似性,IL-18 的受体属于 IL-1R 家族。 35 , 36 , 2 , 37 , 43 )。 因此,我们在 MyD88 检查了 IL-18 介导的生物学功能 -/- 小鼠中 。 IL-18 已被证明是一种有效的自然杀伤 (NK) 细胞激活剂。 35 , 36 , 44 , 45 )。 在存在或不存在 IL-18 的情况下培养脾细胞 24 小时,并通过 分析 NK 裂解活性 51 YAC-1 靶细胞释放 Cr 来 。 具有 IL-18 的脾细胞的体外培养显着增强了野生型小鼠对 YAC-1 细胞的裂解活性( 图 4A )。 然而,IL-18 并未增强 MyD88 NK 裂解活性 -/- 小鼠的 。 在野生型和 MyD88 用 IL-2 刺激脾细胞导致对 YAC-1 细胞的 NK 裂解活性几乎相等的增强 -/- 小鼠中, ,表明 IL-18 介导的 NK 细胞活化在 MyD88 中被特异性干扰 -/- 小鼠( 图 4A )。 除了激活 NK 细胞外,用 IL-18 体外刺激脾细胞会诱导野生型小鼠中的 IFNγ 产生( 图 4B )。 相反,在 MyD88 未观察到响应于 IL-18 的 IFNγ 产生 -/- 小鼠中 ( 图 4B )。 当野生型小鼠用抗去唾液酸 GM1 抗体处理时,体内 NK 细胞数量减少,脾细胞不产生响应 IL-18 的 IFNγ(数据未显示)。 这些数据表明,MyD88 中的 NK 细胞 -/- 小鼠 在响应 IL-18 时促进 IFNγ 产生的能力存在缺陷。 图 4 MyD88 IL-18 介导的 NK 细胞活化受损 -/- 小鼠中 显示完整标题

查看大图 图像 下载高分辨率 图像 下载 (PPT) 此外,最近已经证明 IL-18 不驱动 Th1 发育,而是加强 IL-12 诱导的 Th1 发育。 25 , 38 , 42 )。 幼稚脾 T 细胞与 IL-12 在抗 CD3 抗体包被的板上培养以诱导 Th1 细胞发育。 培养 4 天后,洗涤这些 Th1 发育细胞并在抗 CD3 抗体包被的板上用 IL-18 或 IL-12 再刺激 24 小时。 通过ELISA分析培养物上清液的IFNγ产生。 野生型和MyD88 -/- 通过用抗CD3抗体刺激, T细胞产生几乎相等水平的IFNγ,表明IL-12诱导的体外Th1细胞发育在MyD88 未受损 -/- 小鼠中 。 来自野生型小鼠的 T 细胞响应 IL-18 产生水平升高的 IFNγ( 图 5A )。 相比之下,来自 MyD88 T 细胞 -/- 小鼠的 没有表现出响应 IL-18 的任何增强的 IFNγ 产生。 图 5 MyD88 IL-18 介导的 Th1 反应受损 -/- 小鼠中

已经表明,IL-18 缺陷小鼠在注射 后表现出有缺陷的 Th1 细胞发育 痤疮丙酸杆菌 ( P.acnes )和卡介苗(BCG) ( 42 )。 MyD88 -/- 小鼠注射热灭活的 痤疮丙酸杆菌 ,7 天后纯化脾 T 细胞,并在存在或不存在 IL-18 的情况下用固定的抗 CD3 抗体刺激。 野生型 T 细胞产生显着水平的 IFNγ,并且 IL-18 的存在导致 IFNγ 的产生增加。 相比之下, MyD88 产生的 IFNγ -/- 与野生型相比, T 细胞 严重减少。 此外,在 MyD88 未观察到响应于 IL-18 的 IFNγ 产量增加 -/- T 细胞中 ( 图 5B )。 BCG 感染的野生型小鼠的 T 细胞也产生了大量的 IFNγ 和更高水平的 IFNγ 以响应 IL-18。 然而,来自 BCG 感染的 MyD88 T 细胞的 IFNγ 产量 产量 -/- 小鼠的 比野生型 T 细胞的 低约 3 倍( 图 5B )。 这些结果表明 MyD88 -/- 小鼠在体内 Th1 细胞发育中存在缺陷,与 IL-18 缺陷小鼠的情况一样。 因此,由 IL-18 介导的主要生物活性在 MyD88 中完全消失 -/- 小鼠 。

显性阴性 MyD88 阻断 IL-18 诱导的 NF-κB 和 AP-1 激活

MyD88 -/- 小鼠显示出严重受损的 IL-18 介导的功能。 因此,我们检查了 IL-18R 复合物是否与 MyD88 相互作用,如 IL-1R 复合物的情况所示( 33 , 48 )。 我们将 FLAG 标记的 MyD88 和 Myc 标记的 IL-18R 瞬时共表达到 COS-7 细胞中。 细胞裂解物用抗 Myc 抗体免疫沉淀并用抗 FLAG 抗体印迹。 FLAG 标记的 MyD88 与抗 Myc 抗体共免疫沉淀( 图 6A )。 反过来,Myc 标记的 IL-18R 也与抗 FLAG 抗体共免疫沉淀。 因此,MyD88 特别与 IL-18R 相关联。 图 6 MyD88 与 IL-18 受体相互作用并诱导 NF-κB 和 AP-1 激活 显示完整标题

查看大图 图像 下载高分辨率 图像 下载 (PPT) MyD88 的 C 端结构域(氨基酸 152 至 296)已被证明是 IL-1R 复合物诱导的 NF-κB 激活的显性负抑制剂。 33 , 48 )。 此外,IL-18 显示出与 IL-1 一样诱导 NF-κB 活化( 26 , 38 )。 因此,我们研究了显性失活 MyD88 突变体是否也能阻断 IL-18 诱导的 NF-κB 活化。 COS-7 细胞用 MyD88 (152-296) 表达载体和 NF-κB 依赖性荧光素酶报告基因瞬时转染,并测量 IL-18 处理后的荧光素酶活性。 MyD88 (152-296) 的共表达几乎完全阻断了 IL-18 诱导的 NF-κB 激活( 图 6B 图 ,上 )。 IL-18 还显示激活 AP-1 依赖性基因表达( 1 )。 我们检查了 MyD88(152-296)是否也作为 IL-18 诱导的 AP-1 激活的显性负突变体。 用 IL-18 刺激诱导 AP-1 活性增加约 3 到 4 倍,这种激活被 MyD88 (152-296) 的共表达阻断( 图 6B 图 ,下 )。 总之,这些结果表明 MyD88 参与了 IL-18 诱导的 NF-κB 和 AP-1 激活。

MyD88 中 IL-18 诱导的 NF-κB DNA 结合活性和 JNK 激活的丧失 -/- Th1 发育细胞

我们接下来研究了在 MyD88 是否观察到 IL-18 诱导的 NF-κB 活化 -/- 细胞中 。 将用 IL-12 加抗 CD3 抗体培养 4 天的脾脏 T 细胞饥饿 3 小时,然后用 IL-18 刺激。 使用含有 NF-κB 结合位点的特定探针,通过凝胶迁移率变化测定法分析来自受刺激细胞的核提取物。 所示,在 如图7A 来自野生型细胞但未来自MyD88 的核提取物中检测到IL-18诱导的NF-κB DNA结合活性 -/- 细胞 。 另一方面, 处理野生型或 MyD88 -/- 用 TNF-α 胸腺细胞导致几乎相同水平的 NF-κB DNA 结合活性,证明在 MyD88 受损的 IL-18 诱导的 NF-κB 活化 - 中 /- 细胞不是由于 NF-κB 的功能异常或下调所致。 ç 图 7 MyD88 中响应于 IL-18 的 NF-κB 丢失和 JNK 激活 -/- 细胞 显示完整标题

查看大图 图像 下载高分辨率 图像 下载 (PPT) 除了诱导 NF-κB 激活,IL-1 还显示激活 c-Jun N-末端激酶 (JNK)。 47 )。 为了测试IL-18是否诱导JNK活化,我们使用GST-c-Jun-融合蛋白作为底物进行了体外激酶测定( 图7B )。 用 IL-18 处理诱导野生型小鼠 Th1 发育细胞中的 JNK 活化。 然而,在 MyD88 未观察到 IL-18 诱导的 JNK 活化 -/- 细胞中 。 相比之下,在 MyD88 观察到JNK的正常激活 -/- 用TNF-α处理的 细胞中 。 因此,IL-18 诱导的 NF-κB 和 JNK 激活在 MyD88 被废除 -/- 小鼠中 ,尽管 TNF-α 诱导的激活不受影响。 总之,这些结果表明 MyD88 对 IL-18 诱导的 NF-κB 和 JNK 激活至关重要。 在本研究中,我们证明 MyD88 对 IL-1 和 IL-18 信号传导至关重要,因为这些细胞因子介导的主要功能在 MyD88 中几乎完全消失 -/- 小鼠 。 IL-1R/Toll 相关蛋白家族现在正在哺乳动物中扩展( 27 , 28 )。 这些包括 IL-1R 相关蛋白 (IL-1Rrp)、IL-1Rrp2、T1/ST2 和最近发现的人类 Toll 样分子 (TLR1-5)( 49 , 23 , 29 , 37 , 39 )。 最近,发现 IL-1Rrp 是 IL-18 的受体( 43 )。 几种 IL-1R 相关分子的配体和生物学功能尚未阐明。 MyD88 也可能参与这些孤儿受体(如 IL-1Rrp2、T1/ST2 和 TLR1-5)的信号传导。 因此,使用 MyD88 -/- 小鼠可能有助于阐明这些孤儿受体的功能。 在这方面,值得注意的是, ,MyD88 -/- 当我们考虑到 中的 Toll 通路 时 小鼠是可行的 果蝇 类似于哺乳动物中的 IL-1 通路并且 MyD88 是 的功能性哺乳动物同源物 果蝇 管 ,后者的功能丧失结果在早期胚胎致死由于有缺陷的背腹极性 果蝇 ( 21 , 3 , 34 )。 基于这些发现,哺乳动物 Toll 样分子似乎利用了另一种与 Tube 相关的分子,或者在哺乳动物发育中没有发挥主要作用。 未来的研究将需要回答这个问题。 最后,阻断 MyD88 功能的药物可用于治疗与 IL-1 细胞因子家族过度产生相关的多种病理状况。

实验步骤

MyD88 -/- 小鼠的产生 MyD88 基因组 DNA 从 129/SvJ 小鼠基因组文库(Stratagene)中筛选,亚克隆到 pBluescript 载体(Stratagene)中,并通过限制性内切酶作图和 DNA 测序进行表征。 构建靶向载体以用来自 pMC1-neo (Stratagene) 的新霉素抗性基因替换 1.0 kb 基因组片段。 被替换的基因组片段包含 2 个外显子,其编码的域类似于 IL-1RAcP 的细胞质域。 新霉素抗性基因的两侧是 1.1 kb 5’ 基因组片段和 5.2 kb 3’ 片段。 在基因组片段的 3’ 端引入了 HSV-tk 盒。 E14.1 ES细胞用线性化靶向载体转染并用G418和更昔洛韦选择。 双重抗性克隆通过PCR筛选同源重组,并使用 中 的探针通过Southern印迹分析进行验证 图1A 所示 。 将三个独立鉴定的靶向 ES 克隆显微注射到 C57BL/6 小鼠的囊胚中。 嵌合小鼠与 C57BL/6 雌性小鼠交配产生杂合小鼠。 将杂合小鼠杂交以获得纯合子。 MyD88 -/- 小鼠及其来自这些互交的野生型同窝仔鼠用于实验。

T细胞增殖试验

胸腺细胞 (1 × 10 5 在 2 μg/ml PHA、2.5 μg/ml ConA 或 2 ng/ml IL 存在下,将 ) 与 100 U/ml IL-1β (Genzyme) 在 96 孔板中培养 72 小时-2. [ 3 H]胸苷在最后12小时内脉冲,并 [ 3 测量 H]摄取。 在对 IL-2 有反应的情况下,在 10 ng/ml PMA 或 2.5 μg/ml ConA 存在下,用 20 ng/ml IL-2(Genzyme)培养胸腺细胞。

炎症细胞因子和急性期蛋白的诱导

小鼠静脉注射 1 μg 重组小鼠 IL-1β(Genzyme)。 注射 2 小时后,将小鼠放血以获取血清细胞因子并处死。 使用 TRIZOL 试剂 (GIBCO) 从肝脏中提取总 RNA。 RNA (10 μg) 进行电泳,转移到尼龙膜上,并与 杂交 32 P 标记的 SAA-I、SAP 和 HP cDNA 探针 。 通过ELISA(Genzyme)测定TNF-α和IL-6的血清浓度。

## NK细胞活性分析

脾细胞在有或没有 20 ng/ml IL-18 或 100 U/ml IL-2 的情况下培养 24 小时。 然后,将培养的细胞与 孵育 51 Cr 标记的 YAC-1 靶细胞以指定的效应物/靶标比例 。 孵育 4 小时后, 对上清液的 51 使用伽马计数器 Cr 释放进行计数。 IL-18 由 Hayashibara Biochemistry Laboratories, Inc.(日本)友情提供。

## Th1细胞分化的诱导

如前所述纯化脾 T 细胞( 42 )。 简而言之,脾脏 T 细胞通过两轮尼龙毛柱通道富集。 富集的 T 细胞与抗 IA b 抗体在冰上孵育 30 分钟,然后洗涤并与兔补体(Low-Tox-M,Cedar Lane)在 37°C 下孵育 45 分钟。 使用异硫氰酸荧光素偶联的抗 CD3 抗体(PharMingen)通过流式细胞术分析细胞纯度。 在 2 ng/ml IL-12 存在下,在抗 CD3 Ab (20 μg/ml) 包被的板上培养纯化至 95% 以上的 T 细胞。 培养4天后,收获细胞并用汉克斯平衡盐溶液洗涤。 细胞 (2 × 10 5 在存在或不存在 20 ng/ml IL-18 和/或 2 ng/ml IL 的情况下, ) 在抗 CD3 Ab (20 μg/ml) 包被的 96 孔板上刺激 24 小时-12。 通过ELISA(Genzyme)测定培养物上清液中IFNγ的浓度。 在体内诱导 Th1 细胞发育的情况下,小鼠腹膜内注射 500 μg 热灭活的 痤疮丙酸杆菌 。 注射后 7 天,从脾脏中纯化 T 细胞,并在存在或不存在 20 ng/ml IL-18 的情况下在抗 CD3 Ab (20 μg/ml) 包被的 96 孔板上刺激 24 小时。 对于 BCG 治疗,小鼠静脉注射 2 mg BCG(Kyowa,日本)。 如上所述,在注射后 14 天纯化 T 细胞并检测 IFNγ 的产生。

## 转染、免疫沉淀和蛋白质印迹分析

COS-7 细胞 (1 × 10 6 ) 用总共 10 μg 的指定质粒根据制造商的说明 (Mirus Corporation) 通过 Lipofection 进行瞬时共转染。 36 小时后,在 500 μl 含有 0.5% Nonidet P-40、150 mM NaCl、1 mM EDTA 和 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) 的裂解缓冲液中裂解细胞。 一半的细胞裂解液与 2 μg 抗 FLAG 抗体(Eastman Kodak Company)和 40 μl 蛋白 G Sepharose(Pharmacia)在 4°C 下孵育 12 小时,另一半与 2 μg 抗-Myc 抗体 (Santa Cruz) 和 40 μl 蛋白 A Sepharose (Pharmacia)。 用裂解缓冲液洗涤后,通过在 SDS-PAGE 样品缓冲液中煮沸来洗脱免疫复合物,在 SDS-PAGE 上分离,并转移到硝酸纤维素滤膜上。 滤膜用抗 FLAG 抗体或抗 Myc 抗体印迹,并使用增强型化学发光系统 (Dupont) 进行可视化。

表达质粒

通过 PCR 从人胎盘 cDNA 文库中获得 C 端 FLAG 标记的人 MyD88 和 MyD88(152–296)(氨基酸 152 到 296)cDNA,并连接到哺乳动物表达载体 pEF-BOS( 30 )。 以人 IL-18R cDNA 为模板通过 PCR 获得 C 端 Myc 标记的人 IL-18R cDNA,并连接到 pEF-BOS 中。 人 IL-18R cDNA 由 Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. 友情提供。

记者检测

COS-7 细胞(1 × 10 5 )接种在 6 孔板上,用 1.0 μg 报告质粒(pNF-κB Luc 或 pAP-1 Luc)(Stratagene)与 IL-18R 表达质粒(0.4 μg)瞬时共转染) 和 MyD88 (152–296) (0.6 μg),通过 Lipofection。 通过补充空载体 (pEF-BOS),DNA 的总量保持恒定。 转染 24 小时后,用 1 μg/ml 的重组人 IL-18 刺激细胞 3 小时。 在海三色堇荧光素酶活性 (pRL-SV40) (Promega) 的基础上确定并标准化相对 NF-κB 或 AP-1 活性。 重组人 IL-18 由 Hayashibara Biochemistry Laboratories, Inc. 友情提供。

## 凝胶迁移率变化分析

脾脏 T 细胞被纯化并用 2 ng/ml IL-12 加 100 ng/ml 抗 CD3 抗体培养。 培养 4 天后,洗涤 T 细胞并用含有 2% FCS 的 RPMI 1640 饥饿 3 小时。 细胞 (1 × 10 7 ) 用 100 ng/ml IL-18 刺激 30 分钟。 在 TNF-α 诱导的 NF-κB 激活的情况下,新鲜分离的胸腺细胞 (1 × 10 7 ) 用 100 ng/ml TNF-α 刺激 30 分钟。 细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次并重悬于 400 μl 缓冲液 A(10 mM HEPES [pH 7.8]、10 mM KCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、2 μg/ml 抑肽酶、0.5 mM PMSF 和 0.5 % 海卫 X-100)。 沉淀细胞核,小心地去除细胞质蛋白。 然后将细胞核重新悬浮在缓冲液 C(50 mM HEPES [pH 7.8]、420 ​​mM KCl、0.1 mM EDTA、5 mM MgCl 2 、10% 甘油、1 mM DTT、2 μg/ml 抑肽酶和 0.5 mM PMSF)中。 在 4°C 下涡旋搅拌 30 分钟后,将样品离心,将上清液中的核蛋白转移到新的小瓶中。 核提取物的蛋白质浓度由BCA蛋白质测定试剂(Pierce)测定。 含有两个串联定位的 NF-κB 结合位点(5’-ATCAGGGACTTTCCGCCTGGGGACTTTCCG-3’ 和 5’-GGCGGAAAGTCCCCAGCGGAAAGTCCCTGAT-3’)的双链 NF-κB 特异性寡核苷酸探针用 [α- 标记 32 P]dCTP 由 Klenow 分段。 核提取物 (3 μg) 与 300 fmol 探针在总共 25 μl 的结合缓冲液(10 mM HEPES [pH 7.8]、50 mM KCl、1 mM EDTA、5 mM MgCl 2 、10% 甘油和 2 μg poly-dIdC) 在室温下放置 20 分钟。 对于竞争测定,在添加标记探针之前,将 50 倍摩尔过量的未标记寡核苷酸探针添加到核提取物中 15 分钟。 在添加标记探针之前,通过在 4°C 下与 1 μg 抗 p65 抗体(Santa Cruz)预温育 60 分钟来进行超位移测定。 孵育后,将样品在 4% 聚丙烯酰胺凝胶上分馏在 25 mM Tris-Cl (pH 8.5)、190 mM 甘氨酸和 1 mM EDTA 中。 随后将凝胶干燥并通过放射自显影观察。

体外激酶检测

如上所述制备的 Th1 发育细胞(5 × 10 6 用 100 ng/ml IL-18 刺激 )20 分钟。 新鲜分离的胸腺细胞 (5 × 10 6 ) 用 100 ng/ml TNF-α 刺激 20 分钟。 然后在冰冷的裂解缓冲液中裂解细胞(20 mM Tris-Cl [pH 8.0]、137 mM NaCl、5 mM EDTA、10% 甘油、1% Triton X-100、1 mM PMSF、20 μg/ml 抑肽酶、20 μg/ml Leupeptin、1 mM Na 3 VO 4 、1 mM EGTA、10 mM NaF、1 mM Na 4 P 2 O 7 和10 mM β-甘油磷酸)。 细胞裂解物用蛋白 A-Sepharose 预清除 1 小时,然后与 0.5 μg 兔抗 JNK1 抗体(Santa Cruz)和蛋白 A-Sepharose 混合 12 小时。 珠用裂解缓冲液洗涤四次,用激酶测定缓冲液洗涤一次(25 mM HEPES [pH 7.6]、20 mM MgCl 2 、20 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na 3 VO 4 和2 mM DTT)。 激酶反应在含有 1 μg GST-c-Jun (1–79)-融合蛋白 (Santa Cruz) 和 10 μCi [γ- 20 μl 激酶缓冲液中 32 P] ATP 的 在 30°C 下进行 30 分钟. 加入 20 μl 2×SDS-PAGE 样品缓冲液终止反应。 在 SDS-PAGE 上分离蛋白质并通过放射自显影显色。

致谢

我们感谢 A. Maekawa 的技术援助和 T. Aoki 和 K. Ogishi 的秘书协助。 这项工作得到了日本教育部的资助。

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2.人 MyD88 的克隆和表征:IL-1 受体相关家族的成员

TP 邦纳特 1 , KE Garka , P Parnet , G Sonoda , JR Testa , JE Sims 隶属关系

PMID: 9013863 二: 10.1016 / s0014-5793 (96) 01506-2 

摘要

鼠 MyD88 是一种与白细胞介素 1 受体信号传导域和“死亡域”具有同源性的 RNA,在骨髓白血病细胞系 M1 的分化过程中迅速上调。 我们已经克隆了鼠 MyD88 的人类同源物并重新评估了鼠序列。 两个物种的开放阅读框编码一个 296 个氨基酸的蛋白质,对于鼠 MyD88,它比最初发表的长 53 个氨基酸。 人 MyD88 cDNA 由 5 个外显子编码,并通过荧光原位杂交 (FISH) 定位到染色体 3p21.3-p22。 死亡域区域的过度表达导致 IL-8 启动子的转录激活。

原文

The cloning and characterization of human MyD88: a member of an IL-1 receptor related family

T P Bonnert 1 , K E Garka, P Parnet, G Sonoda, J R Testa, J E Sims Affiliations

PMID: 9013863 DOI: 10.1016/s0014-5793(96)01506-2 

Free article Abstract

Murine MyD88, an RNA with homology both to the interleukin-1 receptor signaling domain and to ‘death-domains’, is rapidly upregulated during differentiation of the myeloleukemic cell line M1. We have cloned the human homologue of murine MyD88 and re-evaluated the murine sequence. The open reading frame for both species encodes a 296 amino acid protein, which for murine MyD88 is 53 amino acids longer than originally published. Human MyD88 cDNA is encoded by 5 exons, and maps to chromosome 3p21.3-p22 by fluorescence in situ hybridization (FISH). Overexpression of the death domain region leads to transcriptional activation of the IL-8 promoter.

3. 癌症中的 Toll 样受体 9 激动剂

莉莉特·卡拉佩延 1 , 杰森 J 卢克 # 1 2 , Diwakar Davar # 1 2 隶属关系

PMID: 33116588 PMCID: PMC7553670 内政部: 10.2147/OTT.S247050 

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摘要

Toll 样受体 9 (TLR9​​) 是一种模式识别受体,主要位于免疫细胞的细胞内,包括树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞 (APC)。 TLR9 受体的主要配体是未甲基化的胞苷磷酸鸟苷 (CpG) 寡二核苷酸 (ODN)。 TLR9 激动剂诱导炎症过程,导致微生物和癌细胞的吸收和杀伤增强以及适应性免疫反应的产生。 TLR9 激动剂的临床前研究表明,无论是作为单一疗法还是与多种药物联合使用都具有疗效,这导致了晚期癌症患者的临床试验。 在这些研究中,已经测试了静脉内、瘤内和皮下给药途径; 在治疗和未治疗的转移部位均具有抗肿瘤反应。 TLR9 激动剂单药治疗是安全的,但对晚期癌症患者的疗效微乎其微; 相反,组合似乎更有希望。 几项正在进行的 I 和 II 期临床试验正在评估 TLR9 激动剂与多种药物的组合,包括化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗药物。 在这篇综述文章中,我们描述了 TLR9 的分布、结构和信号; 讨论 TLR9 激动剂的临床前研究结果; 并审查正在进行的 TLR9 激动剂单独和联合治疗晚期实体瘤患者的临床试验。

关键词: CpG; ODN; 单反; TLR9; 癌症; 癌症免疫疗法; 树突状细胞; 先天激动剂; 先天免疫; toll样受体。 Figure 1 人体中各种 TLR 和相应配体的细胞分布 注意: 由 BioRender.com 创建。 缩写: CpG,胞苷磷酸鸟苷; dsRNA,双链RNA; LPS,脂多糖; ODN,寡二核苷酸; ssRNA,单链RNA; TLR,Toll 样受体。

Figure 2 TLR 和 TLR9 细胞定位和下游信号 注意: 由 BioRender.com 创建。 缩写: AP-1,激活蛋白 1; IRF,干扰素调节因子; IKK,IκB 激酶; MAPK,丝裂原活化蛋白激酶; MyD88,髓系分化初级反应 88; NFκB,核因子κβ; SARM1,无菌 α 和 TIR 基序含有 1; TAK1,转化生长因子-β-活化激酶-1; TLR,toll​​ 样受体; TRIF,包含 TIR 结构域的接头诱导 IFN,β; TRAF6,肿瘤坏死因子受体相关因子 6 (TRAF6); TRAM,TRIF 相关接头分子; TIRAP/MAL,含 TIR 的接头蛋白/MyD88 接头样

4. MyD88 调节 SMAD4 和铁调节激素铁调素的表达

马查桑巴-蒙东加 1 2 , 安妮·卡尔维 1 , 弗雷德里克·A·马莱特 2 3 , 曼努埃拉·桑托斯 1 2 隶属关系

PMID: 30234111 PMCID: PMC6127602 内政部: 10.3389/fcell.2018.00105 

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抽象的

骨髓分化初级反应基因 88 (MyD88) 是一种适应性蛋白,对于通过几乎所有 Toll 样受体 (TLR) 诱导炎症细胞因子至关重要。 TLR 识别微生物中存在的分子模式,称为病原体相关分子模式。 因此,MyD88 在先天免疫中发挥着重要作用,因为它的激活触发了针对微生物的第一道防线。 在此,我们描述了 MyD88 在先天免疫和铁感应途径 (BMP/SMAD4) 之间的相互联系中的首次报道的作用。 我们发现 MyD88 与 SMAD4 蛋白的直接相互作用激活了铁调素表达。 铁调节激素铁调素对于巨噬细胞铁吸收和铁循环的肠道调节是必不可少的。 我们表明 MyD88 以依赖于铁调素基因 ( 上的近端 BMP 响应元件的方式诱导铁调素表达 HAMP ) 启动子 。 我们将 MyD88 的 Toll/interleukin-1 受体 (TIR) 域确定为与 SMAD4 相互作用的域。 此外,我们显示激活 SMAD6 表达的 BMP6 刺激也诱导 MyD88 蛋白体降解,作为限制铁调素诱导的负反馈机制。 最后,我们报告了 MyD88 功能获得性 L265P 突变,在 B 细胞淋巴瘤(如 Waldenström 巨球蛋白血症)中经常遇到,它增强了 B 细胞系中铁调素的表达和铁的积累。 我们的结果揭示了 MyD88 在 SMAD 信号通路和铁稳态调节中的新潜在作用。

关键词: BMP6; L265P 突变; 我的D88; SMAD4; SMAD6; Waldenström 的巨球蛋白血症; 铁调素; 铁。

MyD88 Regulates the Expression of SMAD4 and the Iron Regulatory Hormone Hepcidin

Macha Samba-Mondonga 1 2 , Annie Calvé 1 , Frédérick A Mallette 2 3 , Manuela M Santos 1 2 Affiliations

PMID: 30234111 PMCID: PMC6127602 DOI: 10.3389/fcell.2018.00105 

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Abstract

The myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) is an adaptive protein that is essential for the induction of inflammatory cytokines through almost all the Toll-like receptors (TLRs). TLRs recognize molecular patterns present in microorganisms called pathogen-associated molecular patterns. Therefore, MyD88 plays an important role in innate immunity since its activation triggers the first line of defense against microorganisms. Herein, we describe the first reported role of MyD88 in an interconnection between innate immunity and the iron-sensing pathway (BMP/SMAD4). We found that direct interaction of MyD88 with SMAD4 protein activated hepcidin expression. The iron regulatory hormone hepcidin is indispensable for the intestinal regulation of iron absorption and iron recycling by macrophages. We show that MyD88 induces hepcidin expression in a manner dependent on the proximal BMP responsive element on the hepcidin gene (HAMP) promoter. We identified the Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of MyD88 as the domain of interaction with SMAD4. Furthermore, we show that BMP6 stimulation, which activates SMAD6 expression, also induces MyD88 proteosomal degradation as a negative feedback mechanism to limit hepcidin induction. Finally, we report that the MyD88 gain-of-function L265P mutation, frequently encountered in B-cell lymphomas such as Waldenström’s macroglobulinemia, enhances hepcidin expression and iron accumulation in B cell lines. Our results reveal a new potential role for MyD88 in the SMAD signaling pathway and iron homeostasis regulation.

Keywords: BMP6; L265P mutation; MyD88; SMAD4; SMAD6; Waldenström’s

FIGURE 1 MyD88 表达水平调节 Huh7 肝癌细胞中的内源性 SMAD4 表达。 (A,B) MyD88 过表达增强内源性 SMAD4 表达。 (A) 用空载体 (pCMV) 或 HA 标记的 MyD88 质粒 (pMyD88) 瞬时转染的 Huh7 细胞。 通过蛋白质印迹分析总细胞裂解物的内源性SMAD4表达。 β-肌动蛋白的表达用作上样对照。 (B) 来自三个独立实验的蛋白质印迹中 SMAD4 水平的光密度定量。 (C-E) MyD88 抑制降低内源性 SMAD4 表达。 © 用对照 psiRNA-LucGL3 (si-Ctrl) 或 psiRNA-hMyD88 (si-MyD88) 瞬时转染的 Huh7 细胞中 MyD88 和 SMAD4 表达的代表性蛋白质印迹。 β-肌动蛋白的表达用作上样对照。 (D,E) 的 密度定量 (D) MyD88 和 (E) 来自三个独立实验 SMAD4 蛋白水平的光 。 结果表示为平均值±SEM。 用Student’s 进行统计分析 t 检验 。 FIGURE 2 MyD88 表达水平调节 Huh7 细胞中的内源性铁调素表达。 (A) MyD88 过表达增强内源性铁调素表达。 Huh7 细胞用空载体 (pCMV) 或 HA 标记的 MyD88 质粒 (pMyD88) 瞬时转染,并用 (+) 或不使用 (-) BMP6 处理。 铁调素 ( HAMP ) mRNA 水平通过 RT-PCR 进行评估。 结果表示为平均值±SEM。 ∗ P < 0.01 与载体 (pCMV) 转染细胞 , & P 相比 < 0.01 与未经 BMP6 处理的细胞相比。 (B) MyD88 敲低降低了 Huh7 细胞中的内源性铁调素表达。 Huh7 细胞中的铁调素 mRNA 水平用 si-Ctrl 或 si-MyD88 转染,并用 BMP6 (+) 处理。 结果表示为平均值±SEM。 ∗ P < 0.05 与 si-Ctrl 转染细胞 , 转染细胞和 & P 相比 < 0.05 与 si-MyD88 BMP6 处理相比; ns,与未处理的 si-Ctrl 转染细胞相比不显着。 © HAMP 启动子中 BMP-RE1 的突变消除了 MyD88 对 HAMP-Luc 的诱导。 Huh7 细胞与 HAMP-Luc 或突变的 HAMP-LucΔBMP-RE1 以及 phRL-TK( 瞬时共转染 海肾 作为内部对照的 荧光素酶)和 MyD88 质粒(pCMV 或 lMyD88) 。 BMP6 和激活素 B 处理用作对照。 转染后 24 小时评估荧光素酶活性。 结果表示为相对活性的平均值±SEM( 萤火虫 / 海肾 比率)。 ∗∗ P < 0.001、 ∗∗∗ P < 0.0001 和 ns,与空质粒 (pCMV) 相比不显着。 结果代表至少三个独立实验。 使用单向方差分析进行统计分析。 FIGURE 3 MyD88 通过 MyD88 的 Toll/Interleukin-1 受体 (TIR) 结构域直接与 SMAD4 相互作用。 (A–C) MyD88 与 SMAD4 的共免疫沉淀。 (A) MyD88 KO HEK293 细胞 (HEK293-I3A) 用带有 HA 标签的 MyD88 和带有 Flag 标签的 SMAD4 进行瞬时转染。 使用抗 Flag、抗 HA 或正常 IgG 抗体(作为对照)对细胞裂解物进行免疫沉淀 (IP),并使用抗 HA 抗体通过免疫印迹 (IB) 进行分析以检测 MyD88 和抗 Flag 抗体检测 SMAD4。 (B) 内源性 MyD88 与 Flag 标记的 SMAD4 的共免疫沉淀,以及内源性 SMAD4 与 HA 标记的 MyD88 的共免疫沉淀。 © 在用 BMP6 (+BMP6) 处理 24 小时的 Huh7 细胞中,内源性 MyD88 与内源性 SMAD4 的共免疫沉淀。 (D,E) MyD88 的 TIR 域是其与 SMAD4 相互作用所必需的。 HEK293-I3A细胞用pCMV-HA-MyD88或三种MyD88缺失质粒之一瞬时转染,如 所示 (E) 。 (D) 提取总细胞裂解物 (TCL),与 GST-SMAD4 孵育,并使用指定抗体通过蛋白质印迹分析。 (E) 编码不同截短形式的 MyD88 的质粒的示意图。 FL,全长; DD,死亡域; TIR,Toll/Interleukin-1 受体结构域; ID,中间域。 (F-H) 有缺陷的 MyD88 突变体(ΔTIR 结构域)消除了 MyD88 过表达对内源性 SMAD4 和 HAMP 启动子激活的诱导。 Huh7 细胞用 HAMP-Luc 和 pCMV 或 HA 标记的 MyD88 载体(pMyD88)或缺少 TIR 结构域的 MyD88 载体(pMyD88ΔTIR)转染。 (F) 通过蛋白质印迹分析内源性 SMAD4 和转染的 HA 标记的 MyD88 的表达。 β-肌动蛋白用作上样对照。 (G) 来自三个独立实验的蛋白质印迹中 SMAD4 水平的光密度定量。 (H) 转染后 24 小时评估荧光素酶活性。 结果表示为相对活性的平均值±SEM( 萤火虫 / 海肾 比率)。 数据代表最少三个实验。 统计分析采用单向方差分析; ns,与 pCMV 相比不显着。 FIGURE 4 MyD88 通过 BMP6 和激活素 B 诱导的降解进行调节。 (A) BMP6 和激活素 B 诱导 MyD88 泛素化。 Huh7 细胞用 HA 标记的 MyD88 和 His 标记的泛素 (His-Ubi) 共转染,并用 BMP6 或激活素 B 处理。使用抗 His 抗体通过免疫沉淀 (IP) 检查 HA-MyD88 泛素化,然后进行免疫印迹(IB)与抗-HA抗体。 IP 前的总细胞裂解物 (TCL) 用抗 HA 和抗 β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。 (B) BMP6 和激活素 B 降低内源性 MyD88 蛋白水平。 Huh7 细胞未经处理 (-) 或用指定剂量 (12.5、25 和 50 ng/ml) 的 BMP6 或激活素 B 处理 (+)。 TGF-β 用作对照(15 ng/ml)。 使用抗 MyD88 抗体通过免疫印迹分析 TCL。 β-肌动蛋白的表达用作上样对照。 © 蛋白酶体抑制剂 MG132 防止 BMP6 和激活素 B 诱导的 MyD88 降解。在蛋白酶体抑制剂 MG132 存在 (-) 或不存在 (-) 的情况下,用 BMP6 或激活素 B (25 ng/ml) 处理 Huh7 细胞(10 μM) 4 小时。 (D,E) Huh7 细胞中 SMAD6 和 SMURF1 的过表达抑制 HAMP-Luc 活性并与内源性 MyD88 表达的变化相关。 (D) Huh7 细胞与 HAMP-Luc 结合空质粒 (pCMV)、pSMAD6 或 pSMURF1 进行瞬时共转染。 转染后 24 小时评估荧光素酶活性。 结果表示为相对活性的平均值±SEM( 萤火虫 / 海肾 比率)。 使用单向方差分析进行统计分析。 ∗∗∗ P < 0.0001。 (E) 使用抗 MyD88 抗体通过免疫印迹分析 TCL。 β-肌动蛋白的表达用作上样对照。 所有数据代表至少三个独立实验。 FIGURE 5 MyD88 L265P 突变增强 B 细胞系中铁调素的表达和细胞内铁的积累。 (A) MyD88 L265P 突变体与 SMAD4 相互作用。 MyD88 KO HEK293T 细胞(HEK293-I3A)用 pCMV(对照)或 HA 标记的 MyD88(作为 Wt)或 HA-MyD88L265P(作为 L265P)以及带有 Flag 标记的 SMAD4 进行瞬时转染。 细胞裂解物用抗 Flag 抗体进行免疫沉淀 (IP),并通过免疫印迹 (IB) 分析,用抗 HA 抗体检测 MyD88,用抗 Flag 抗体检测 SMAD4。 IP 前的总细胞裂解物(输入)用抗 HA、抗 Flag 和抗 β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。 (B,C) MyD88 L265P 突变体上调 B 细胞系中的铁调素表达。 (B) Namalwa 和 © Raji B 细胞系与 HAMP-MetLuc2 和对照 (pCMV) 或 MyD88 质粒 (pMyD88) 共转染:野生型 (Wt) 或突变型 MyD88 (L265P)。 转染后 24 小时评估荧光素酶活性。 数据来自至少三个独立实验。 (D,E) MyD88 L265P 突变体增加 B 细胞系的细胞内铁含量。 (D) Namalwa 和 (E) Raji B 细胞系与 HAMP-MetLuc2 和对照 (pCMV) 或 MyD88 质粒 (pMyD88) 共转染:野生型 (Wt) 或突变型 MyD88 (L265P)。 使用 QuantiChrom Iron Assay Kit 测定细胞内铁浓度。 铁的浓度以每10 μg铁给出 6 个 活细胞的 并且数据来自至少三个独立实验。 (F,G) MyD88 L265P 突变体降低铁转运蛋白 1 的表达。 (F) Namalwa 细胞与 HAMP-MetLuc2 和对照 (pCMV) 或 MyD88 质粒 (pMyD88) 共转染:野生型 (Wt) 或突变型 MyD88 (L265P)。 总细胞裂解物通过蛋白质印迹分析铁转运蛋白 1 和 β-肌动蛋白作为上样对照。 (G) 来自三个独立实验的蛋白质印迹中铁转运蛋白 1 水平的光密度定量。 使用单向方差分析进行统计分析。 结果表示为平均值±SEM。 ∗ P < 0.05、 ∗∗ P < 0.001、 ∗∗∗ P < 0.0001 和 ns,与空质粒 (pCMV) 相比不显着。

5 人 MyD88 的分子表征和模块分析

G哈迪曼 1 , FL Rock , S Balasubramanian , RA Kastelein , JF Bazan 隶属关系

PMID: 8957090 

抽象的

MyD88 首次被表征为小鼠骨髓分化初级反应基因,在白细胞介素 6 (IL-6) 诱导生长停滞和终末分化后在 M1 骨髓白血病细胞中激活。 对来自活化树突细胞文库的表达序列标签 (EST) 的分析导致鉴定出编码人类同源物 (hMyD88) 的 cDNA。 MyD88 作为 243 aa 蛋白的原始描述可能反映了截短的小鼠 cDNA,因为 2682 nt hMyD88 cDNA 预测了 296 aa 细胞质蛋白。 与该提议一致的是在人类心脏、肾脏和肝脏组织中检测到 33 kDa 的蛋白质。 MyD88 的表达模式也比最初认为的更广泛:发现 2.6 kb hMyD88 mRNA 种类在许多成人组织中组成型表达; 此外,在单核细胞、T、B、NK 和树突细胞中观察到 MyD88 表达。 MyD88 蛋白具有模块化结构,由类似于 TNF 受体 1 (TNFR1) 和 FAS 的细胞内片段的 N 端“死亡域”(DD) 和与脊椎动物白细胞介素 1 的信号域相关的 C 端区域组成受体 (IL-1R) 和果蝇形态发生素 Toll。 这种有趣的结构框架可能赋予 MyD88 独特的信号功能

原文

Molecular characterization and modular analysis of human MyD88

Abstract

MyD88 was first characterized as a myeloid differentiation primary response gene in mice, activated in M1 myeloleukemic cells following interleukin-6 (IL-6) induced growth arrest and terminal differentiation. Analysis of expressed sequence tags (ESTs) from activated dendritic cell libraries led to the indentification of cDNAs encoding the human homolog (hMyD88). The original description of MyD88 as a 243 aa protein may reflect a truncated mouse cDNA since the 2682 nt hMyD88 cDNA predicts a 296 aa cytoplasmic protein. Consistent with this proposal is the detection of a 33 kDa protein in human heart, kidney and liver tissue. The expression pattern of MyD88 is also more widespread than originally believed: a 2.6 kb hMyD88 mRNA species was found to be constitutively expressed in many adult human tissues; in addition MyD88 expression was observed in monocyte, T, B, NK and dendritic cells. The MyD88 protein has a modular structure composed of an N-terminal ‘death domain’ (DD) similar to the intracellular segments of TNF receptor 1 (TNFR1) and FAS and a C-terminal region related to the signaling domains of vertebrate interleukin-1 receptors (IL-1R) and the Drosophila morphogen Toll. This intriguing structural framework may endow MyD88 with unique signaling capabilities.

6 MyD88 的遗传结构和染色体定位

G哈迪曼 1 , NA Jenkins , NG Cop​​eland , DJ Gilbert , DK Garcia , SL Naylor , RA Kastelein , JF Bazan 隶属关系

PMID: 9344657 内政部: 10.1006/geno.1997.4940 

抽象的

骨髓分化 (MyD) 标记 MyD88 最初被表征为初级反应基因,在小鼠 M1 骨髓白血病细胞中上调以响应白细胞介素 6 诱导的分化。 随后的分析表明,MyD88 具有独特的模块结构,由 N 端“死亡域”组成,类似于 TNF 受体 1 和 Fas 的细胞内片段,以及与果蝇形态发生素的细胞质域相关的 C 端区域Toll 和脊椎动物白细胞介素-1 受体。 在本报告中,我们描述了小鼠 MyD88 的克隆和基因结构。 小鼠 MyD88 的完整编码序列跨越五个外显子,第一个外显子编码完整的死亡域。 Zooblot 分析显示 MyD88 是一个进化上保守的基因。 MyD88 通过种间回交作图定位于小鼠 9 号染色体的远端区域。 通过对人染色体 3 体细胞杂交作图面板的 PCR 分析,将人同源物 (hMyD88) 定位到染色体 3p22-p21.3。 Northern印迹分析揭示了MyD88在许多成年小鼠组织中的广泛表达,RT-PCR研究在T和B细胞系以及分化的胚胎干细胞中检测到MyD88 mRNA。 广泛的表达模式表明,小鼠 MyD88 的表达并不限于最初认为的髓系细胞。

原文

Genetic structure and chromosomal mapping of MyD88

G Hardiman 1 , N A Jenkins, N G Copeland, D J Gilbert, D K Garcia, S L Naylor, R A Kastelein, J F Bazan Affiliations

PMID: 9344657 DOI: 10.1006/geno.1997.4940 

Abstract

The myeloid differentiation (MyD) marker MyD88 was initially characterized as a primary response gene, upregulated in mouse M1 myeloleukemic cells in response to differentiation induced by interleukin-6. Subsequent analysis revealed that MyD88 possesses a unique modular structure, which consists of an N-terminal “death domain,” similar to the intracellular segments of TNF receptor 1 and Fas, and a C-terminal region related to the cytoplasmic domains of the Drosophila morphogen Toll and vertebrate interleukin-1 receptors. In this report we describe the cloning and gene structure of mouse MyD88. The complete coding sequence of mouse MyD88 spans five exons, with the first exon encoding the complete death domain. Zooblot analysis revealed that MyD88 is an evolutionarily conserved gene. MyD88 was localized to the distal region of mouse chromosome 9 by interspecific backcross mapping. The human homolog (hMyD88) was mapped to chromosome 3p22-p21.3 by PCR analysis of a human chromosome 3 somatic cell hybrid mapping panel. Northern blot analysis revealed widespread expression of MyD88 in many adult mouse tissues, and RT-PCR studies detected MyD88 mRNA in T and B cell lines and differentiating embryonic stem cells. The broad expression pattern demonstrates that mouse MyD88 expression is not restricted to cells of myeloid lineage as was originally believed.

7. MyD88-5 连接神经元中的线粒体、微管和 JNK3 并调节神经元存活

Younghwa Kim 1 , Ping Zhou , Liping Qian , Jen-Zen Chuang , Jessica Lee , Chenjian Li , Costantino Iadecola , Carl Nathan , Aihao Ding 隶属关系

PMID: 17724133 PMCID: PMC2118693 内政部: 10.1084 / jem.20070868 

免费 PMC 文章 抽象的

先天免疫系统依赖进化上保守的 Toll 样受体 (TLR) 来识别不同的微生物分子结构。 大多数 TLR 依赖于称为 MyD88s 的适配器蛋白家族来转导它们的信号。 MyD88-1-4 在宿主防御中的关键作用通过基因敲除小鼠的免疫反应缺陷得到证实。 相比之下,脊椎动物 MyD88-5 的表达位点和功能仍然难以捉摸。 我们表明 MyD88-5 不同于其他 MyD88,因为 MyD88-5 优先在神经元中表达,部分与线粒体和 JNK3 共定位,并调节神经元死亡。 我们通过细菌人工染色体制备了 MyD88-5/GFP 转基因小鼠,以保留其内源性表达模式。 MyD88-5/GFP 主要在大脑中检测到,它与神经元内的点状结构相关,部分与线粒体共纯化。 在体外,MyD88-5 与 JNK3 共免疫沉淀并将 JNK3 从细胞质中募集到线粒体。 来自 MyD88-5 缺陷小鼠的海马神经元在氧气和葡萄糖被剥夺后免受死亡。 相比之下,MyD88-5-null 巨噬细胞在对微生物产物的反应中表现得像野生型细胞。 因此,MyD88-5 在 MyD88s 中似乎是独一无二的,在调节压力诱导的神经元毒性方面发挥作用。 图

图1。 Figure 1. MyD88-5 主要在大脑中表达,但不在骨髓细胞中表达。 (A) 使用两个 SAM 结构域和部分 TIR 结构域 (1,200–1,816 bp) 作为探针对小鼠组织中 MyD88-5 表达的 Northern 印迹分析。 肌动蛋白探针用作加载对照。 (B) 使用针对全长重组小鼠 MyD88-5 的鸡抗体进行的蛋白质印迹显示,小鼠脑(左泳道)和转染了 Flag 标记的 MyD88-5 构建体(右泳道)的 COS-1 细胞中存在 79-kD 多肽,填充箭头),但在载体转染的 COS-1 细胞(中心泳道)中没有。 空心箭头表示非特异性条带。 © 小鼠组织和细胞中 MyD88-5 转录物的相对定量。 在脑中表达最高,在淋巴结 (LN) 和纯化的脾 T 细胞中表达中等,但在耗尽 T 和 B 细胞 (T-B-) 的脾群体(主要是巨噬细胞)中几乎检测不到。 数据是针对小鼠 GAPDH 标准化的定量实时 PCR 结果,并表示为脑中水平的百分比。 显示了三个独立实验之一。 (D) 人体组织和细胞中 MyD88-5 转录物的相对定量。 人 MyD88-5 mRNA 的表达在大脑中最高,在淋巴细胞中可检测到 (L)。 从人血中纯化多形核白细胞 (PMN)、单核细胞 (M) 和淋巴细胞。 三个独立实验之一的数据以 C 表示。 (E) MyD88-5 在成年小鼠大脑不同解剖区域的表达。 数据以 C 表示,来自两个独立实验之一。 (F) MyD88-5 在发育过程中在小鼠大脑中的表达。 E12-18,受孕后的胚胎天数; P1-60,产后天数。 qRT-PCR 结果针对 GAPDH 进行标准化,并显示为成人大脑中 MyD88-5 表达的百分比。

图 2。 Figure 2. 表达 MyD88-5-GFP 融合蛋白的转基因小鼠的产生及其在脑神经元中的表达。 (A) BAC 克隆 RP23-399H5 中 MyD88-5 基因座的示意图、靶向载体以及修饰的 MyD88-5 基因座的预测结构。 指示了外显子编号。 用于 Southern 印迹的探针以红色显示。 显示了限制位点和预测的片段大小。 去除了外显子 9 中的终止密码子,并在框内引入了 GFP。 (B) 来自转基因 (Tg) 和非转基因小鼠的受限基因组 DNA 的代表性 Southern 印迹。 下面显示的转基因拷贝数是通过比较内源条带(实心箭头)和转基因条带(空心箭头)的强度来计算的。 © 内源性 MyD88-5 和 MyD88-5/GFP 融合蛋白在转基因小鼠脑中的表达。 (左)使用抗 MyD88-5 抗体进行蛋白质印迹。 (右)使用抗 GFP 抗体进行蛋白质印迹。 融合蛋白的预期分子量为 105 kD。 (D) MyD88-5/GFP 在转基因小鼠脑中的广泛表达。 来自非转基因小鼠(左)和转基因(右)小鼠的脑切片与抗 GFP 抗体一起染色。 (E) MyD88-5/GFP 的神经元表达。 荧光共聚焦显微镜从转基因创始人小鼠的未染色脑切片中捕获了直接的 GFP 信号。 右图是从左边开始放大的插图。 棒材:(D) 1 毫米; (E, 左) 200 μm; (E,右)20 微米。

图 3。 Figure 3. MyD88-5 的线粒体关联。 (A) MyD88-5/GFP 融合蛋白与线粒体和微管的选择性共定位。 COS-1 细胞用 MyD88-5/GFP 融合构建体转染。 转染后 18 小时,细胞用 MitoTracker Red CMXRos 染色 20 分钟,然后固定或固定、透化并用高尔基体抗体(抗-γ-适应蛋白)或微管(抗微管蛋白)染色。 (B) MyD88-5 与线粒体的外在关联。 用 MyD88-5/GFP 转染并用 MitoTracker Red CMXRos 染色的 COS-1 细胞的共聚焦显微图像。 (上)表达较低水平的 MyD88-5 的细胞; (底部)表达更高水平的 MyD88-5 的细胞,对线粒体形状和定位有影响。 (右)来自左侧图像的盒装区域的放大图像。 © 有助于亚细胞定位和线粒体关联的 MyD88-5 域的分析。 COS-1 细胞用指定的构建体转染。 18 小时后,线粒体在固定前用 MitoTracker Red CMXRos 染色。 (D) 部分共纯化内源性 MyD88-5 和转基因 MyD88-5/GFP 与来自大脑的线粒体。 通过差速离心从野生型(非 Tg)或转基因(Tg)小鼠脑中分离线粒体,并用抗 MyD88-5(顶部)、GFP(中间)或 TOM-23(底部)的抗体对裂解物进行蛋白质印迹。 TOM-23 是一种内在的线粒体膜蛋白,其相对丰度用作加载控制。 (E) 共纯化来自小鼠大脑的内源性 MyD88-5 和微管。 在通过蔗糖梯度离心纯化之前,微管要么在 37°C 下与紫杉醇和 GTP 聚合,要么在 4°C 下与秋水仙碱聚合。 纯化的微管级分(沉淀)、未聚合级分(sup)和总脑裂解物(总裂解物)用针对 MyD88-5 的抗体进行蛋白质印迹。 棒,10 微米。

图 4。 MyD88-5 依赖性 JNK3 募集到线粒体。 (A) 在 MyD88-5 存在下 JNK3 重新分布到线粒体。 COS-1 细胞用 MyD88-5/GFP 和 RFP(顶部)、GFP 和 JNK3/RFP(中间)或 MyD88-5/GFP 和 JNK3/RFP(底部)转染。 线粒体用 MitoTracker Red CMXRos 染色。 酒吧,10 微米。 (B) 来自转染的 COS-1 细胞的 MyD88-5 与 JNK3/GFP 的共免疫沉淀,但不单独与 GFP 共沉淀。 免疫沉淀使用抗 GFP 抗体和蛋白 G-Sepharose,蛋白质印迹使用 MyD88-5(顶部)或 GFP(底部)抗体。 空心箭头表示非特异性条带。 © MyD88-5 与 JNK3 在来自野生型 (WT) 或 MyD88-5 敲除 (KO) 小鼠的海马切片中的共免疫沉淀。 一半的脑切片预先暴露于 120 焦耳/米 2 的紫外线下。 用抗 JNK1,3 和蛋白 G-Sepharose 进行免疫沉淀,用抗 JNK3 和抗 MyD88-5 进行蛋白质印迹。

图 5。MyD88-5 基因敲除小鼠的产生及其海马神经元免受 OGD 诱导的细胞死亡的保护。 (A) MyD88-5 基因座示意图、靶向载体和突变基因座的预测结构。 指示了外显子编号。 用于 Southern 印迹的探针以红色显示。 显示了限制酶位点和消化的预测大小。 Sp,SphI; Neo,新霉素抗性基因; DTX,白喉毒素基因。 (B) 来自 MyD88-5 野生型、半合子缺陷型和无效小鼠的基因组 DNA 的 Southern 印迹分析。 © 野生型、半合子缺陷和空小鼠中 MyD88-5 表达的蛋白质印迹分析。 对 50 μg 脑裂解物进行 SDS-PAGE。 亲和纯化的鸡抗 MyD88-5 抗体用于检测。 (D) 在 OGD 期开始时(基础)、OGD 后(OGD)或没有 OGD 治疗的同一时期(假手术)以及暴露于 1 mM NMDA 后,海马切片中死神经元的碘化丙啶染色以诱导最大细胞死亡 (Max)。 图示的海马来自 MyD88-5 +/- (Het) 或 MyD88-5 -/- 小鼠 (KO)。 酒吧,1 毫米。 (E) MyD88-5 +/+ (假手术, n = 6;OGD, n = 13)MyD88-5 +/- (假手术, n = 11;OGD, n = 22) 和 MyD88-5 -/- (sham, n = 5; OGD, n = 29) 切片。 P < 0.05,学生 t 检验。

原文

Abstract

The innate immune system relies on evolutionally conserved Toll-like receptors (TLRs) to recognize diverse microbial molecular structures. Most TLRs depend on a family of adaptor proteins termed MyD88s to transduce their signals. Critical roles of MyD88-1-4 in host defense were demonstrated by defective immune responses in knockout mice. In contrast, the sites of expression and functions of vertebrate MyD88-5 have remained elusive. We show that MyD88-5 is distinct from other MyD88s in that MyD88-5 is preferentially expressed in neurons, colocalizes in part with mitochondria and JNK3, and regulates neuronal death. We prepared MyD88-5/GFP transgenic mice via a bacterial artificial chromosome to preserve its endogenous expression pattern. MyD88-5/GFP was detected chiefly in the brain, where it associated with punctate structures within neurons and copurified in part with mitochondria. In vitro, MyD88-5 co-immunoprecipitated with JNK3 and recruited JNK3 from cytosol to mitochondria. Hippocampal neurons from MyD88-5-deficient mice were protected from death after deprivation of oxygen and glucose. In contrast, MyD88-5-null macrophages behaved like wild-type cells in their response to microbial products. Thus, MyD88-5 appears unique among MyD88s in functioning to mediate stress-induced neuronal toxicity.

8. MyD88 作为巨噬细胞中淀粉样蛋白 β 诱导的炎症信号转导的衔接蛋白

苏菲·奥哈罗兰 1 , 艾丽西亚·奥利里 1 , 特恩·库伊佩尔 1 , 埃里克·J·唐纳 2 隶属关系

PMID: 25124962 内政部: 10.1016/j.imlet.2014.08.001 

抽象的

神经炎症是神经组织控制感染的复杂先天免疫反应,Toll 样受体 (TLR) 是模式识别受体 (PRR) 的一个主要家族,在阿尔茨海默病 (AD) 的进展中起着关键作用。 先天免疫细胞,包括巨噬细胞,控制定制的炎症基因表达以调节炎症反应,但巨噬细胞在 AD 发病机制中的作用尚不清楚。 除 TLR3 外,所有 TLR 均募集 MyD88 接头,并且有证据表明该接头在小鼠 AD 模型的炎症和认知变化中发挥作用,此外还有细胞水平的淀粉样蛋白 (Aβ) 诱导的炎症信号传导。 在本研究中,我们使用 Aβ 在永生化巨噬细胞中诱导炎症信号传导。 本文提供的数据表明,Aβ 促进了 NF-κB 的核隔离,并将巨噬细胞极化为 M1 表型,对促炎细胞因子的表达产生下游影响。 重要的是,缺乏 MyD88 的巨噬细胞会加剧 Aβ 诱导的 TNF-α 产生,而缺乏 MyD88 会促进 NF-κB 活化,增强 M1 和 M2 极化,并损害巨噬细胞的活力。 我们证明,在没有 MyD88 的情况下,丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 在导致 TNF-α 表达的级联中充当 Aβ 靶向的上游信号中间体。 我们的研究结果为 MyD88 在 AD 发病机制的细胞机制中提供了新的作用,表明 MyD88 接头是调节巨噬细胞中 Aβ 诱导的炎症信号传导的关键。

Abstract

Neuroinflammation is the complex innate immune response of neural tissue to control infection, and Toll-like receptors (TLRs), a major family of pattern recognition receptors (PRRs), have a key role in Alzheimer’s disease (AD) progression. Innate immune cells, including macrophages, govern tailored inflammatory gene expression to regulate inflammatory responses, however the role of macrophages in AD pathogenesis is not clear. All TLRs, with the exception of TLR3, recruit the MyD88 adaptor, and evidence indicates a role for this adaptor in inflammatory and cognitive changes in mouse AD models, in addition to amyloid-beta (Aβ)-induced inflammatory signalling at a cellular level. In the present study, we employed the use of Aβ to induce inflammatory signalling in immortalized macrophages. Data presented herein demonstrate that Aβ promoted the nuclear sequestration of NF-κB, and polarized macrophages to an M1 phenotype with downstream consequences on pro-inflammatory cytokine expression. Importantly, Aβ-induced TNF-α production was exacerbated in macrophages lacking MyD88, while MyD88 deficiency promoted NF-κB activation, enhanced M1 and M2 polarization, and compromised macrophage viability. We demonstrate that in the absence of MyD88, mitogen-activated protein kinase (MAPKs) act as upstream signalling intermediates targeted by Aβ in the cascade leading to TNF-α expression. Our findings offer a new role for MyD88 in cellular mechanisms underlying AD pathogenesis, indicating that MyD88 adaptors are key in regulating Aβ-induced inflammatory signalling in macrophages.

9. 螯合体 1 和组蛋白脱乙酰酶 6 对 MyD88 聚集和 MyD88 依赖性信号通路的调节

武进 1 , 惠猪股 , Shumpei仁井田 , Yukitaka村上 , 健一郎柴田 隶属关系

PMID: 20837465 PMCID: PMC2975200 内政部: 10.1074/jbc.M110.126904 

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MyD88 是 Toll 样受体 (TLR) 和白细胞介素 (IL)-1 受体的重要衔接分子。 MyD88 被认为在细胞质中以浓缩形式或聚集结构存在,尽管原因尚不清楚。 在这里,我们显示内源性 MyD88 以小斑点状凝聚结构存在,其形成取决于 MyD88 二聚化。 此外,大型聚集结构的形成与 sequestosome 1 (SQSTM1;也称为 p62) 和组蛋白去乙酰化酶 6 (HDAC6) 的细胞质积累有关,它们参与多泛素化蛋白质的积累。 一项基因敲低研究表明,SQSTM1 和 HDAC6 是 MyD88 聚集所必需的,并且对 TLR 配体诱导的 RAW264.7 细胞中 IL-6 和 NOS2 的表达具有抑制作用。 SQSTM1 和 HDAC6 部分参与了几种 TLR4 介导的信号事件的抑制,包括 p38 和 JNK 的激活,但它们几乎不影响 IκBα(核因子 κB 抑制剂)的降解。 MyD88 寡聚化的生化诱导诱导 SQSTM1 和 HDAC6 募集到 MyD88-TRAF6 信号复合体。 SQSTM1 和 HDAC6 的抑制增强了 MyD88-TRAF6 复合物的形成,相反地降低了泛素特异性负调节因子 CYLD 与复合物的相互作用。 此外,SQSTM1 和 HDAC6 上的泛素结合区域对于 MyD88 聚集是必不可少的,但不是与 MyD88 复合物相互作用所必需的。 因此,我们的研究表明,SQSTM1 和 HDAC6 不仅是 MyD88 聚集定位的重要决定因素,而且 MyD88 还激活了多泛素化蛋白质积累机制,该机制对 MyD88 依赖性信号转导具有调节作用。

Regulation of MyD88 aggregation and the MyD88-dependent signaling pathway by sequestosome 1 and histone deacetylase 6

Takeshi Into 1 , Megumi Inomata, Shumpei Niida, Yukitaka Murakami, Ken-ichiro Shibata Affiliations

PMID: 20837465 PMCID: PMC2975200 DOI: 10.1074/jbc.M110.126904 

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Abstract

MyD88 is an essential adaptor molecule for Toll-like receptors (TLRs) and interleukin (IL)-1 receptor. MyD88 is thought to be present as condensed forms or aggregated structures in the cytoplasm, although the reason has not yet been clear. Here, we show that endogenous MyD88 is present as small speckle-like condensed structures, formation of which depends on MyD88 dimerization. In addition, formation of large aggregated structures is related to cytoplasmic accumulation of sequestosome 1 (SQSTM1; also known as p62) and histone deacetylase 6 (HDAC6), which are involved in accumulation of polyubiquitinated proteins. A gene knockdown study revealed that SQSTM1 and HDAC6 were required for MyD88 aggregation and exhibited a suppressive effect on TLR ligand-induced expression of IL-6 and NOS2 in RAW264.7 cells. SQSTM1 and HDAC6 were partially involved in suppression of several TLR4-mediated signaling events, including activation of p38 and JNK, but they hardly affected degradation of IκBα (inhibitor of nuclear factor κB). Biochemical induction of MyD88 oligomerization induced recruitment of SQSTM1 and HDAC6 to the MyD88-TRAF6 signaling complex. Repression of SQSTM1 and HDAC6 enhanced formation of the MyD88-TRAF6 complex and conversely decreased interaction of the ubiquitin-specific negative regulator CYLD with the complex. Furthermore, ubiquitin-binding regions on SQSTM1 and HDAC6 were essential for MyD88 aggregation but were not required for interaction with the MyD88 complex. Thus, our study reveals not only that SQSTM1 and HDAC6 are important determinants of aggregated localization of MyD88 but also that MyD88 activates a machinery of polyubiquitinated protein accumulation that has a modulatory effect on MyD88-dependent signal transduction.

FIGURE 1. MyD88 的二聚化诱导凝聚结构的形成。 A ,RAW264.7 细胞中内源性 MyD88 的免疫荧光图像。 细胞未经处理或用 1 μg/ml 大肠杆菌 LPS 处理 60 分钟。 免疫荧光染色 ( IF 用抗 MyD88 抗体(从 Abcam 获得)和 Alexa 488 偶联的抗小鼠 IgG 抗体对细胞进行 )。 图像代表三个独立实验。 箭头 ,MyD88 聚合结构; 比例尺 ,10 微米。 B ,表达 MyD88-EGFP 的活 293T 细胞( 荧光图像 左 )和稳定表达 FLAG-MyD88 的 RAW264.7 细胞( 右 )的 。 活 293T 细胞的形态由微分干涉对比显微镜确定。 使用抗 FLAG 和 Alexa 488 抗小鼠 IgG 抗体对 RAW264.7 细胞进行免疫荧光染色。 C ,稳定表达 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞的免疫荧光图像。 细胞用 1 μ 米 香豆霉素 10–60 分钟或 10 μ 米 新生霉素 30 分钟。 用抗 FLAG 和 Alexa 488 抗小鼠 IgG 抗体对细胞进行免疫荧光染色。 图像代表三个独立实验。 比例尺 ,10 微米。 D 和 E ,稳定表达 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞百分比的量化,具有小斑点状凝聚结构( D )和直径超过 1μm 的结构( E )。 细胞用 1 μ 米 香豆素或 10 μ 米 在指定时期内使用新生霉素。 用抗 FLAG 和 Alexa 488 抗小鼠 IgG 抗体对细胞进行免疫荧光染色。 结果显示为平均值 ± SE ( n = 3),是从包括至少 30 个细胞的三个显微视野图像中获得的,代表三个独立实验。 F ,稳定表达直径超过 1 μm 结构的 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞百分比的量化。 细胞用 1 μ 米 香豆霉素,1微克/毫升帕姆 3 CSK 4 ,100纳克/毫升LPS,或10μ 米 指定时期的 CpG ODN 1826。 用抗 FLAG 和 Alexa 488 抗小鼠 IgG 抗体对细胞进行免疫荧光染色。 结果,显示为平均值 ± SE( 误差条 )( n = 3),是从包括至少 30 个细胞的三个显微视野图像中获得的,并且代表了三个独立实验。

FIGURE 2. SQSTM1 和 HDAC6 在 TLR 刺激后浓缩在细胞质中。 甲 和 Ç ,父母RAW264.7细胞未处理或者用1μg/ ml的帕姆刺激 3 CSK 4 ,100纳克/毫升LPS,或10μ 米 CpG ODN 1826 30 或 180 分钟。 用 1 μ 刺激稳定表达 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞 米 香豆霉素 30 分钟。 然后将细胞固定并用抗 SQSTM1 抗体 ( A ) 或抗 HDAC6 抗体 ( C ) 和 Alexa488 偶联的抗兔 IgG 抗体染色。 比例尺 ,20 μm。 B 和 D ,具有 SQSTM1 或 HDAC6 凝聚结构的亲本 RAW264.7 细胞百分比的量化。 将细胞用1μg/ ml的帕姆刺激 3 CSK 4 ,100纳克/毫升LPS,或10μ 米 指定时期的 ODN 1826。 细胞的免疫荧光染色 ( IF ) 用抗 SQSTM1 抗体 ( B ) 或抗 HDAC6 抗体 ( D ) 和 Alexa488 偶联的抗兔 IgG 抗体进行。 结果显示为平均值 ± SE( 误差条 )( n = 5),是从包括至少 30 个细胞的五个显微视野图像中获得的,代表三个独立实验。

FIGURE 3. SQSTM1 和 HDAC6 参与 MyD88 聚合结构的形成。 A ,对稳定表达 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞中直径超过 1 μm 结构的细胞百分比进行量化。 细胞用针对 siRNA 库 转染 Sqstm1 和 Hdac6 的 或用对照 siRNA 。 24 h 后,细胞用 1 μ 米 在指定时期使用香豆霉素。 用抗 FLAG 和 Alexa 488 抗小鼠 IgG 抗体对细胞进行免疫荧光染色。 结果显示为平均值 ± SE ( IP ) ( n = 3),是从包括至少 30 个细胞的三个显微视野图像中获得的,代表三个独立实验。 *, p < 0.01 用于与对照 siRNA 组进行比较。 B ,与 SQSTM1 和 HDAC6 共免疫沉淀的内源性 MyD88 的免疫印迹分析。 RAW264.7 细胞不刺激或用 1 μg/ml LPS 刺激 1 小时。 然后 免疫沉淀 ( IP 使用 Dynabeads 蛋白 A 和抗 SQSTM1、抗 HDAC6 或抗 GAPDH 抗体对澄清的细胞裂解物进行 ),然后用抗 MyD88、抗 SQSTM1 和抗 HDAC6 抗体进行免疫印迹。 结果代表三个独立实验。

FIGURE 4. SQSTM1 和 HDAC6 与 MyD88 聚合结构共存。 A-D ,RAW264.7 细胞未经处理( A 和 C )或用 1 μg/ml LPS 刺激 1 小时( B 和 D )。 然后将细胞固定并用抗 MyD88 兔多克隆抗体和 Alexa488 偶联的抗兔 IgG 抗体染色,然后用抗 SQSTM1 小鼠单克隆抗体( A 和 B )或抗 HDAC6 小鼠单克隆抗体( C 和 D )和 Alexa564 染色-偶联的抗小鼠 IgG 抗体。 比例尺 ,10 微米。 E-H ,稳定表达 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞未经处理( E 和 G )或用 1 μ 刺激 米 香豆霉素 30 分钟( F 和 H )。 然后将细胞固定并用抗 FLAG 小鼠单克隆抗体和 Alexa488 偶联的抗小鼠 IgG 抗体染色,然后用抗 SQSTM1 兔多克隆抗体( E 和 F )或抗 HDAC6 兔多克隆抗体( G 和 H )和 Alexa564 染色-偶联的抗兔 IgG 抗体。 比例尺 ,10 微米。

FIGURE 5. SQSTM1和HDAC6对TLR刺激诱导的促炎基因表达的影响。 A , 中 表达水平 Sqstm1 和 Hdac6 的 亲代 RAW264.7 细胞 。 将细胞用1μg/ ml的帕姆刺激 3 CSK 4 ,100纳克/毫升LPS,或10μ 米 指定时期的 ODN 1826。 的表达水平 Sqstm1 和 Hdac6 通过qRT-PCR测定细胞中 。 每个值表示为 的平均值 ± SD( 误差条 三个独立实验 ),以对照组为 1(*, p < 0.01;†, p < 0.05,用于与对照组进行比较)。 乙 ,用siRNA转染的对RAW264.7细胞 SQSTM1 或 HDAC6 或用对照siRNA与1μg/ ml的帕姆刺激 3 CSK 4 ,100纳克/毫升LPS,或10μ 米 ODN 1826 6 小时。 的表达水平 SQSTM1 , HDAC6 , IL6 , NOS2 , TNF ,和 Nfkbiz 在细胞通过qRT-PCR测定。 每个值表示为三个独立实验的平均值 ± SD,以对照组为 1(*, p < 0.01;†, p < 0.05,用于与对照组进行比较)。

FIGURE 6. SQSTM1 和 HDAC6 对 LPS 激活的信号事件的影响。 用针对 siRNA 转染的亲本 RAW264.7 细胞的免疫印迹分析 Sqstm1 或 Hdac6 的 。 在指定的时间段内用 100 ng/ml LPS 刺激细胞。 使用针对磷酸化 ( 抗体通过免疫印迹分析全细胞裂解物 p -) JNK、p38、ERK、Akt 和 IκBα 的 。 总 JNK、p38、ERK、Akt、SQSTM1 和 HDAC6 作为加载对照。 结果代表三个独立实验。 对通过三个独立实验获得的所有免疫印迹条带进行光密度定量。 磷酸-p38、磷酸-JNK、磷酸-ERK、磷酸-Akt (Ser 473 ) 和磷酸-Akt (Thr 308 ) 的每个值都针对总 p38、总 JNK、总 ERK、总 Akt 和总 Akt,分别。 结果表示为 的平均值±SE( 误差条 三个独立实验 )和通过将对照值(对照siRNA,0 分钟)设为1 的倍数增加。*, p < 0.05,用于与对照组进行比较。

FIGURE 7. 将 SQSTM 和 HDAC6 募集到 MyD88 信号复合体及其对 CYLD 的调节作用。 A ,稳定表达 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞中 MyD88 二聚化诱导信号复合物组分的免疫印迹分析。 细胞用 1 μ 米 在指定时期使用香豆霉素。 然后 免疫沉淀 ( IP 用澄清的细胞裂解物进行抗 FLAG-琼脂糖 ),然后用抗 TRAF6、抗 SQSTM1、抗 HDAC6、抗 CYLD 和抗 FLAG 抗体进行免疫印迹。 结果代表三个独立实验。 B ,稳定表达FLAG-MyD88-GyrB的RAW264.7细胞中MyD88二聚化诱导信号复合物中TRAF6、SQSTM1和HDAC6的免疫印迹分析。 用 100 ng/ml LPS( 刺激细胞 左 )和 2.5 μg/ml Pam 3 CSK 4 ( 右 在指定时间段内 ) 。 用澄清的细胞裂解物进行抗 FLAG-琼脂糖的免疫沉淀。 结果代表三个独立实验。 C ,稳定表达FLAG-MyD88-GyrB的RAW264.7细胞用针对 siRNA池 转染 Sqstm1 或 Hdac6的 或用对照siRNA 。 细胞用 1 μ 米 在指定时期使用香豆霉素。 用澄清的细胞裂解物进行抗 FLAG-琼脂糖的免疫沉淀,然后对 TRAF6、CYLD、SQSTM1、HDAC6 和 FLAG-MyD88-GyrB 进行免疫印迹分析。 结果代表三个独立实验。

FIGURE 8. SQSTM1 和 HDAC6 泛素结合域的作用。 A ,SQSTM1、HDAC6 及其突变体构建体的示意图。 CAT ,脱乙酰酶催化结构域。 B ,MyD88 与 SQSTM1、HDAC6 及其突变蛋白相互作用的免疫印迹分析。 293T 细胞用 FLAG-MyD88 与 HA-SQSTM1、HA-SQSTM1 ΔUBA、HA-HDAC6、酶失活的 HA-HDAC6 或 HA-HDAC6 ΔBUZ 一起转染。 免疫沉淀 ( IP 用澄清的细胞裂解物进行抗 FLAG 琼脂糖 ),然后 进行免疫印迹 ( IB 用抗 FLAG 和抗 HA 抗体 )。 ns ,非特异性条带。 C ,稳定表达具有凝聚结构的 FLAG-MyD88-GyrB 的 RAW264.7 细胞百分比的量化。 细胞用 HA-SQSTM1、HA-SQSTM1 ΔUBA、HA-HDAC6、无酶活性的 HA-HDAC6 或 HA-HDAC6 ΔBUZ 转染。 24 小时后,细胞用 0.1 μ 米 香豆霉素 30 分钟。 用抗 FLAG 和 Alexa 488 抗小鼠 IgG 抗体对细胞进行免疫荧光染色。 结果,显示为平均值 ± SE( 误差条 )( n = 3),是从包括至少 30 个细胞的三个显微视野图像中获得的,并且代表了三个独立实验。 *, p < 0.01 用于与空向量组进行比较。

FIGURE 9. MyD88 通过 SQSTM1 和 HDAC6 诱导蛋白质积累途径的示意图。 详情见“讨论”。 Ub ,泛素。

10. SPOP 通过破坏 MyD88 自关联负向调节 Toll 样受体诱导的炎症

Yun-Hong Hu 1 , Yang Wang 1 , Fei Wang 1 , Yan-Ming Dong 1 , Wan-Ling Jiang 1 , Ya-Ping Wang 1 , Xing Zhong 2 , Li-Xin Ma 3 隶属关系

PMID: 32235916 PMCID: PMC8245473 内政部: 10.1038/s41423-020-0411-1 

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Toll 样受体 (TLR) 信号通路需要受到严格控制,以避免过度炎症和对宿主造成不必要的损害。 骨髓分化初级反应基因 88 (MyD88) 是 TLR 信号转导的关键接头。 在这里,我们将斑点型 POZ 蛋白 (SPOP) 鉴定为 MyD88 相关蛋白。 在 TLR4 激活后,SPOP 被招募到 MyD88。 TLR4 激活也导致 SPOP 从细胞核到细胞质的易位。 SPOP 耗竭促进了 MyD88 的聚集和下游信号激酶 IRAK4、IRAK1 和 IRAK2 的募集。 一致地,SPOP 的过表达抑制了 TLR4 介导的 NF-κB 激活和炎性细胞因子的产生,而 SPOP 消耗具有相反的效果。 此外,在 TLR2、TLR7 和 TLR9 激活后,敲除 SPOP 会增加 MyD88 聚集和炎性细胞因子的产生。 我们的研究结果揭示了 MyD88 受调节的机制,并突出了 SPOP 在限制炎症反应中的作用。

关键词: 我的D88; SPOP; 单反; 炎。

SPOP negatively regulates Toll-like receptor-induced inflammation by disrupting MyD88 self-association

Abstract

Toll-like receptor (TLR) signaling pathways need to be tightly controlled to avoid excessive inflammation and unwanted damage to the host. Myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) is a critical adaptor of TLR signaling. Here, we identified the speckle-type POZ protein (SPOP) as a MyD88-associated protein. SPOP was recruited to MyD88 following TLR4 activation. TLR4 activation also caused the translocation of SPOP from the nucleus to the cytoplasm. SPOP depletion promoted the aggregation of MyD88 and recruitment of the downstream signaling kinases IRAK4, IRAK1 and IRAK2. Consistently, overexpression of SPOP inhibited the TLR4-mediated activation of NF-κB and production of inflammatory cytokines, whereas SPOP depletion had the opposite effects. Furthermore, knockdown of SPOP increased MyD88 aggregation and inflammatory cytokine production upon TLR2, TLR7 and TLR9 activation. Our findings reveal a mechanism by which MyD88 is regulated and highlight a role for SPOP in limiting inflammatory responses.

Keywords: MyD88; SPOP; TLR; inflammation.

Fig. 1. SPOP interacts with MyD88. ( a )全长 MyD88、SPOP 及其突变体的示意图。 ( b ) MyD88 和 SPOP 交互的域映射。 HEK293细胞(2×10 6 )用指定的表达质粒(每个5μg)转染。 用抗 HA 或对照小鼠 IgG 进行共免疫沉淀。 (上)免疫沉淀物通过免疫印迹与抗 Flag 进行分析。 (下)转染蛋白质的表达通过免疫印迹与指定的抗体进行分析。 ( c )MyD88与THP-1细胞中SPOP的内源性关联。 THP-1 细胞 (1 × 10 8 ) 未处理或用 LPS (100 ng/mL) 处理指定时间。 用指定的抗体进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。 ( d )在 RAW264.7 细胞中 MyD88 与 SPOP 的内源性关联。 RAW264.7 细胞 (1 × 10 8 ) 未经处理或用 LPS (100 ng/mL) 处理指定时间。 用指定的抗体进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。 ( e )含有 SPOP 和 MyD88 的复合物的凝胶过滤分析。 THP-1 细胞 (1 × 10 8 ) 在裂解前用 LPS 处理 1 小时或不处理。 在 Superdex 200 柱上通过尺寸排阻色谱分析细胞裂解物。 分别用抗 SPOP 和抗 MyD88 通过蛋白质印迹分析各个级分。 ( f ) SPOP 在体外与 MyD88 相互作用。 纯化的 GST 或 GS​​T-MyD88 用于下拉纯化的 His-SPOP。 结合到珠子上的蛋白质通过免疫印迹分析用指定的抗体(上)进行分析。 纯化的蛋白质用考马斯亮蓝(下)染色。

Fig. 2. SPOP is translocated to the cytoplasm upon LPS stimulation. ( a )SPOP 在细胞质和细胞核中均有表达。 分离来自 THP-1 细胞 (3 × 10 细胞质和细胞核部分 7 ) 的 ,平衡至等体积,并使用指定抗体通过免疫印迹进行分析。 ( b )亚细胞级分的细胞分级和免疫印迹分析。 BMDMs (3 × 10 7 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间。 进行细胞分级; 将级分平衡至等体积,并通过使用指定抗体(上)的免疫印迹进行分析。 LPS 刺激后 SPOP 的整个细胞水平通过免疫印迹与抗 SPOP(下)进行分析。 ( c )SPOP细胞定位的共聚焦显微镜。 HEK293 细胞 (1 × 10 5 用 TLR4-Flag (100 ng)、MD2-Flag (50 ng) 和 mCherry-SPOP (50 ng) 的表达质粒转染 )。 转染后 20 小时,细胞用 LPS (100 ng/mL) 处理或不处理 1 小时,然后用 4% 多聚甲醛固定并进行共聚焦显微镜检查。 Cyt,细胞质; 核,核。

Fig. 3. SPOP negatively regulates TLR4-mediated signaling pathways. ( a )SPOP对LPS诱导的 TNFA 、 IL1B 和 IL6 基因转录的影响。 用空对照载体或 Flag-SPOP 质粒转染 THP-1 细胞以建立稳定的细胞系。 细胞 (4 × 10 5 来自两种稳定细胞系的 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定时间,然后制备总 RNA 用于 qPCR 分析。 通过免疫印迹分析检查稳定细胞系中 SPOP 的表达(右)。 ( b )SPOP对LPS诱导的TNFα、IL-1β和IL-6细胞因子的影响。 用空对照载体或 Flag-SPOP 质粒转染 THP-1 细胞以建立稳定的细胞系。 细胞 (4 × 10 5 来自两种稳定细胞系的 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间,然后收集培养基用于 ELISA 测定。 ( c )SPOP-RNAi对SPOP表达和 TNFA 、 IL1B 和 IL6 基因转录的影响。 THP-1 细胞(4 × 10 5 用对照或指定的 SPOP 特异性 siRNA(每个 2 μg)转染 )。 40 小时后,将细胞用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间,然后制备总 RNA 用于 qPCR 分析。 通过免疫印迹分析检查 SPOP 的表达,使用 ImageJ 对 SPOP 条带进行定量,并通过对照蛋白 β-肌动蛋白的水平(右)进行标准化。 ( d )SPOP-RNAi对LPS诱导的TNFα、IL-1β和IL-6细胞因子的影响。 THP-1 细胞(4 × 10 5 用对照或指定的 SPOP 特异性 siRNA(每个 2 μg)转染 )。 40 小时后,将细胞用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间,然后收集培养基用于 ELISA 测定。 ( e )SPOP的过表达抑制LPS诱导的信号传导。 对照或 Flag-SPOP 稳定表达的细胞 (4 × 10 5 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间,然后用指定的抗体进行免疫印迹。 ( f )敲除 SPOP 增强 LPS 诱导的信号传导。 THP-1 细胞(4 × 10 5 用对照或指定的 SPOP 特异性 siRNA(每个 2 μg)转染 )。 40 小时后,将细胞用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间,然后用指定的抗体进行免疫印迹。 图表显示平均值 ± SD, n = 3。* p < 0.05; ** p < 0.01。

Fig. 4. SPOP disturbs MyD88 self-association. ( a ) SPOP 敲除对 MyD88 泛素化的影响。 WT 或 SPOP 缺陷的 THP-1 细胞 (1 × 10 8 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间。 细胞被裂解,裂解物用抗-MyD88 免疫沉淀。 用指定的抗体进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。 ( b ) SPOP 破坏了 MyD88 的自关联。 HEK293 细胞(2 × 10 6 )用指定的质粒(每个 5 μg)转染 20 小时,然后用指定的抗体进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。 ( c )SPOP缺乏增加LPS诱导的MyD88的聚集。 WT 或 SPOP 缺陷的 THP-1 细胞 (1 × 10 7 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间,细胞裂解物通过天然或 SDS PAGE 分离,并通过使用指定抗体的免疫印迹分析. ( d )WT或SPOP基因敲除细胞中含有MyD88的复合物的凝胶过滤分析。 WT 或 SPOP 缺陷的 THP-1 细胞 (1 × 10 8 ) 在裂解前用 LPS (100 ng/mL) 处理 1 小时。 在 Superdex 200 柱上通过尺寸排阻色谱分析细胞裂解物。 用抗-MyD88 通过蛋白质印迹分析各个级分。 ( e )SPOP缺乏增加LPS诱导的IRAK1/2/4向MyD88的募集。 WT 或 SPOP 缺陷的 THP-1 细胞 (1 × 10 8 ) 用 LPS (100 ng/mL) 处理指定的时间。 用指定的抗体进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。 Fig. 5. SPOP is specifically involved in the TLR-MyD88-mediated signaling. ( a ) SPOP 对 TLR2 信号的影响。 RAW264.7 细胞(4 × 10 5 )用指定的 siRNA(每个 2 μg)转染 40 小时。 然后将细胞用 PGN (50 μg/mL) 处理 2 小时,并制备总 RNA 用于 qPCR 分析。 ( b ) SPOP 对 TLR3 信号传导的影响。 实验与( 中类似地进行 a 除了刺激物是Poly(I:C) (50 μg/mL)之外, ) 。 ( c )SPOP对TLR7信号传导的影响。 实验与( 类似地进行 a 除了刺激是R848(40 nM)之外, ) 。 ( d ) SPOP 对 TLR9 信号的影响。 实验与( 中类似地进行 a 除了刺激是CpG(2μM)之外, ) 。 ( e )抑制 SPOP 增加了 PGN 诱导的 MyD88 的聚集。 RAW264.7 细胞(2 × 10 6 )用对照siRNA或SPOP-siRNA#2(各10 μg)转染40小时,然后用PGN(50 μg/mL)处理指定时间。 细胞裂解物如所示通过天然或 SDS-PAGE 分离,并通过使用所示抗体的免疫印迹进行分析。 ( f )SPOP 的敲低增加了 R848 诱导的 MyD88 的聚集。 实验与( 中类似地进行 e 除了刺激是R848(40 nM)之外, ) 。 ( g )抑制 SPOP 增加了 CpG 诱导的 MyD88 的聚集。 实验与( 中类似地进行 e 除了刺激是CpG(2μM)之外, ) 。 图表显示平均值 ± SD, n = 3。* p < 0.05; ** p < 0.01。

11.巨噬细胞分化标记物 MyD88 是 Toll /IL-1 受体家族的成员

作者链接打开覆盖面板 Hultmark D。 https://doi.org/10.1006/bbrc.1994.1206 获取权利和内容 抽象的

哺乳动物中的白细胞介素1受体和 的产物 Toll 基因 果蝇 中 是相关的跨膜受体,参与 转录因子的激活 rel 家族 。 虽然白细胞介素 1 受体介导白细胞介素 1 在免疫系统中的作用,但 Toll 是决定 背腹极性的系统的一部分 在 果蝇 果蝇 胚胎 ,尽管 Toll 也可能 的免疫反应中起作用。 在这里,我证明 MyD88(一种在骨髓分化中诱导的基因)的开放阅读框与白细胞介素 1 受体和 的细胞质结构域有关 Toll 基因产物 。 这三个相关的蛋白质定义了一个信号传递器家族,其原始功能可能是介导免疫系统中的反应。

Macrophage Differentiation Marker MyD88 Is a Member of the Toll/IL-1 Receptor Family

Author links open overlay panelHultmarkD. https://doi.org/10.1006/bbrc.1994.1206 Get rights and content

Abstract

The interleukin-1 receptor in mammals and the product of the Toll gene in Drosophila are related transmembrane receptors, involved in the activation of transcription factors of the rel family. Whereas the interleukin-1 receptor mediates the effects of interleukin-1 in the immune system, Toll is part of the system that determines dorsoventral polarity in the Drosophila embryo, although Toll may also have a function in the immune response in the fly. Here, I demonstrate that the open reading frame of MyD88, a gene induced in myeloid differentiation, is related to the cytoplasmic domains of the interleukin-1 receptor and the Toll gene product. The three related proteins define a family of signal transmitters, the original function of which may be to mediate responses in the immune system.

12. MyD88:一种将 IRAK 募集到 IL-1 受体复合物的适配器

韦舍 1 , WJ Henzel , W Shillinglaw , S Li , Z Cao 隶属关系

PMID: 9430229 二: 10.1016 / s1074-7613 (00) 80402-1 

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抽象的

IL-1 是一种促炎细胞因子,它通过两个不同跨膜链的受体复合物发出信号,以产生多种细胞反应,包括转录因子 NF-kappaB 的激活。 在这里,我们展示了 MyD88(一种先前描述的功能未知的蛋白质)在 IL-1 刺激后被募集到 IL-1 受体复合物。 MyD88 结合 IRAK(IL-1 受体相关激酶)和两条受体链的异源复合物(信号复合物),从而介导 IRAK 与受体的结合。 MyD88 的异位表达或其含有死亡域的 N 端激活 NF-kappaB。 MyD88 的 C 端与 IL-1 受体相互作用并阻断由 IL-1 而非 TNF 诱导的 NF-kappaB 激活。 因此,MyD88 在 IL-1 信号传导中的作用与 TRADD 和 Tube 分别在 TNF 和 Toll 通路中的作用相同:它将丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶偶联到受体复合物上。

MyD88: an adapter that recruits IRAK to the IL-1 receptor complex

H Wesche 1 , W J Henzel, W Shillinglaw, S Li, Z Cao Affiliations

PMID: 9430229 DOI: 10.1016/s1074-7613(00)80402-1 

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Abstract

IL-1 is a proinflammatory cytokine that signals through a receptor complex of two different transmembrane chains to generate multiple cellular responses, including activation of the transcription factor NF-kappaB. Here we show that MyD88, a previously described protein of unknown function, is recruited to the IL-1 receptor complex following IL-1 stimulation. MyD88 binds to both IRAK (IL-1 receptor-associated kinase) and the heterocomplex (the signaling complex) of the two receptor chains and thereby mediates the association of IRAK with the receptor. Ectopic expression of MyD88 or its death domain-containing N-terminus activates NF-kappaB. The C-terminus of MyD88 interacts with the IL-1 receptor and blocks NF-kappaB activation induced by IL-1, but not by TNF. Thus, MyD88 plays the same role in IL-1 signaling as TRADD and Tube do in TNF and Toll pathways, respectively: it couples a serine/threonine protein kinase to the receptor complex.

13. MyD88 及更高版本:MyD88 靶向治疗方法调节宿主免疫的观点

卡迈勒·乌赛克 1 隶属关系

PMID: 33834387 PMCID: PMC8031343 内政部: 10.1007/s12026-021-09188-2 

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抽象的

传染性病原体的不断出现以及抗菌素耐药性产生了对治疗传染病的替代方法的需求。 靶向与免疫信号通路密切相关以调节宿主免疫的宿主因子可用于治疗广泛的传染病。 病原体相关配体与 Toll 样/IL-1R 家族和其他细胞受体结合,随后募集细胞内信号转导蛋白,主要是 MyD88,触发先天免疫反应。 但是宿主先天免疫的激活强烈依赖于受到严格调控的 MyD88 的正确功能。 MyD88 的失调可能导致失衡,最终导致各种炎症相关的综合征和疾病。 此外,最近的报告还描述了 MyD88 在许多病毒感染中的上调与抗病毒 I 型 IFN 反应的降低有关,并且 MyD88 缺陷小鼠的生存能力有所提高。 这些报告表明,MyD88 也通过与 MyD88 无关的免疫信号通路负向参与抗病毒 I 型 IFN 反应。 由于其在控制宿主免疫信号通路中的作用不断扩大,MyD88 已被公认为更广泛的药物发现范式中的潜在药物靶点。 针对 MyD88 的 BB 环,通过基于结构的方法设计小分子抑制剂,该方法通过阻断 TIR-TIR 结构域同二聚化,在减轻 MyD88 介导的炎症影响方面显示出有希望的治疗效果,并增加了实验小鼠的抗病毒 I 型干扰素反应疾病模型。 在这篇综述中,我们重点介绍了有关 MyD88 相关免疫反应和 MyD88 靶向治疗方法的报告,以及控制炎症和抗病毒 I 型 IFN 反应的潜在机制。 亮点: • 宿主先天免疫在 PAMP 与 PRR 结合后被激活,随后通过包含 TIR 结构域的接头蛋白(主要是 MyD88)发出免疫信号。 • 基于结构的方法导致开发出小分子抑制剂,该抑制剂可阻断 MyD88 的 TIR 结构域同二聚化,并在限制小鼠严重炎症相关影响方面显示出治疗功效。 • MyD88 的治疗干预也显示出抗病毒作用的增加,强 I 型 IFN 信号与通过 MyD88 非依赖性途径增加的 IRF 磷酸化有关。 • MyD88 抑制剂可能用作小分子疗法,用于调节宿主对炎症性疾病的免疫力和抗病毒疗法。 • 然而,之前临床使用更深入的努力应侧重于该方法在复杂疾病(包括 COPD 和 COVID-19)中的适用性,以将炎症相关综合征限制为感染。

关键词: 干扰素-β; 脂多糖; 我的D88; 保利 I:C; 斯博; 败血症; TLR。

MyD88 and beyond: a perspective on MyD88-targeted therapeutic approach for modulation of host immunity

Kamal U Saikh 1 Affiliations

PMID: 33834387 PMCID: PMC8031343 DOI: 10.1007/s12026-021-09188-2 

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Abstract

The continuous emergence of infectious pathogens along with antimicrobial resistance creates a need for an alternative approach to treat infectious diseases. Targeting host factor(s) which are critically involved in immune signaling pathways for modulation of host immunity offers to treat a broad range of infectious diseases. Upon pathogen-associated ligands binding to the Toll-like/ IL-1R family, and other cellular receptors, followed by recruitment of intracellular signaling adaptor proteins, primarily MyD88, trigger the innate immune responses. But activation of host innate immunity strongly depends on the correct function of MyD88 which is tightly regulated. Dysregulation of MyD88 may cause an imbalance that culminates to a wide range of inflammation-associated syndromes and diseases. Furthermore, recent reports also describe that MyD88 upregulation with many viral infections is linked to decreased antiviral type I IFN response, and MyD88-deficient mice showed an increase in survivability. These reports suggest that MyD88 is also negatively involved via MyD88-independent pathways of immune signaling for antiviral type I IFN response. Because of its expanding role in controlling host immune signaling pathways, MyD88 has been recognized as a potential drug target in a broader drug discovery paradigm. Targeting BB-loop of MyD88, small molecule inhibitors were designed by structure-based approach which by blocking TIR-TIR domain homo-dimerization have shown promising therapeutic efficacy in attenuating MyD88-mediated inflammatory impact, and increased antiviral type I IFN response in experimental mouse model of diseases. In this review, we highlight the reports on MyD88-linked immune response and MyD88-targeted therapeutic approach with underlying mechanisms for controlling inflammation and antiviral type I IFN response. HIGHLIGHTS: • Host innate immunity is activated upon PAMPs binding to PRRs followed by immune signaling through TIR domain-containing adaptor proteins mainly MyD88. • Structure-based approach led to develop small-molecule inhibitors which block TIR domain homodimerization of MyD88 and showed therapeutic efficacy in limiting severe inflammation-associated impact in mice. • Therapeutic intervention of MyD88 also showed an increase in antiviral effect with strong type I IFN signaling linked to increased phosphorylation of IRFs via MyD88-independent pathway. • MyD88 inhibitors might be potentially useful as a small-molecule therapeutics for modulation of host immunity against inflammatory diseases and antiviral therapy. • However, prior clinical use of more in-depth efforts should be focused for suitability of the approach in deploying to complex diseases including COPD and COVID-19 in limiting inflammation-associated syndrome to infection.

Keywords: IFN-β; LPS; MyD88; Poly I: C; SEB; Sepsis; TLRs. 图 Fig. 1 MyD88 具有由三个主要结构域组成的模块化结构:N 端死亡结构域 (DD)(54 至 109)、中间结构域(INT)(110 至 155)和 Toll-白细胞介素-1 受体结构域(TIR)(155到 296)

Fig. 1 MyD88 has a modular structure composed of three main domains: an N-terminal death domain (DD) (54 to 109), intermediate domain (INT) (110 to 155), and Toll-interleukin-1 receptor domain (TIR) (155 to 296)

Fig. 2 MyD88 介导的促炎信号的示意图,基于 MyD88 的 TIR 域中的 BB 环结构设计的小分子在小鼠中显示出对 SEB 中毒的治疗效果 制 Fig. 3 MyD88 靶向治疗抗病毒 I 型反应的合理机

14. MyD88 作为炎症性肺病的治疗靶点

佛朗哥·迪帕多瓦 1 , Valerie FJ Quesniaux 2 , 伯恩哈德·里菲尔 2 3 隶属关系

PMID: 29658361 内政部: 10.1080/14728222.2018.1464139 

抽象的

髓样分化初级反应蛋白 88 (MyD88) 是一种关键的衔接蛋白,参与控制先天免疫反应和炎症的 Toll 样和 IL-1 受体家族信号传导。 MyD88 功能的基因缺失导致炎症的深度抑制和宿主对病原体的抵抗力降低,表明 MyD88 的非冗余作用。 TIR 结构域对于 MyD88 二聚化和 TLR 和 IL-1R 家族受体的信号传导至关重要。 涵盖领域:新出现的证据表明,TIR 结构域的化学破坏会减弱细胞活化并抑制体内 MyD88 依赖性炎症。 我们回顾了 MyD88 二聚化干扰物作为呼吸系统疾病的新型治疗方法的发展,重点是 COPD。 专家意见:有一个概念证明,MyD88 的治疗靶向是可行的,第一个临床前数据非常有希望。 这为治疗 COPD 和其他慢性呼吸系统疾病的恶化提供了绝佳机会。 然而,需要进行广泛的临床前研究和风险分析,仔细评估宿主抵抗力降低和机会性感染。

关键词: 慢性阻塞性肺病; Myd88 抑制剂; 白细胞介素; 炎; toll样受体

MyD88 as a therapeutic target for inflammatory lung diseases

Franco Di Padova 1 , Valerie F J Quesniaux 2 , Bernhard Ryffel 2 3 Affiliations

PMID: 29658361 DOI: 10.1080/14728222.2018.1464139 

Abstract

Myeloid differentiation primary response protein 88 (MyD88) is a critical adaptor protein involved in Toll-like and IL-1 receptor family signaling controlling innate immune responses and inflammation. Genetic deletion of MyD88 function results in profound suppression of inflammation and reduced resistance of the host to pathogens indicating non-redundant roles of MyD88. The TIR domain is critical for MyD88 dimerization and signaling for TLR and IL-1R family receptor. Areas covered: Emerging evidence suggests that chemical disruption of the TIR domain attenuates cell activation and inhibits in vivo MyD88-dependent inflammation. We review the development of MyD88 dimerization disruptors as a novel therapeutic approach of respiratory diseases with a focus on COPD. Expert opinion: There is a proof of concept that therapeutic targeting of MyD88 is feasible and first preclinical data are highly promising. This opens a great opportunity to treat exacerbations of COPD and other chronic respiratory diseases. However, extensive preclinical investigations and risk analyses are required with carefully evaluation of reduced host resistance and opportunistic infections.

Keywords: COPD; Myd88 inhibitor; iinterleukin; inflammation; toll-like receptor.

15. 关键进展:一种新型拟肽化合物抑制 MyD88 二聚化和 IRAK1 和 IRAK4 的募集

玛丽亚·洛亚罗 1 , 费德里卡Capolunghi , 尼古拉Fantò , 格拉齐亚加洛 , 西尔维娅坎普 , Brunilde Arseni , 丽塔Carsetti , 保罗Carminati , 丽塔德桑蒂斯 , 维托·鲁杰罗 , 克劳迪奥·塞特 隶属关系

PMID: 17548806 二: 10.1189 / jlb.1206746 

抽象的

MyD88 是一种衔接蛋白,在 IL-1R 和几种 TLR 引发的细胞内信号传导中起重要作用。 其功能的核心是其 Toll/IL-1R 翻译起始区 (TIR) 结构域能够与受体异二聚化并与另一个 MyD88 分子同二聚化以促进下游信号分子的募集,例如丝氨酸/苏氨酸激酶 IL- 1R 相关激酶 1 (IRAK1) 和 IRAK4。 在此,我们合成并测试了合成肽模拟化合物 (ST2825) 的活性,该化合物模仿 MyD88-TIR 域的 BB 环中的七肽结构,干扰 MyD88 信号传导。 ST2825 在免疫共沉淀实验中抑制 MyD88 二聚化。 这种效应对 TIR 结构域的同源二聚化具有特异性,并且不影响死亡结构域的同源二聚化。 此外,ST2825 通过MyD88 干扰IRAK1 和IRAK4 的招募,从而抑制IL-1beta 介导的NF-kappaB 转录活性的激活。 口服后,ST2825 剂量依赖性地抑制 IL-1beta 诱导的 IL-6 在治疗小鼠中的产生。 最后,我们观察到 ST2825 抑制 B 细胞增殖和分化为浆细胞,以响应 CpG 诱导的 TLR9 激活,TLR9 是一种需要 MyD88 进行细胞内信号传导的受体。 我们的结果表明,ST2825 通过干扰 MyD88 同源二聚化来阻断 IL-1R/TLR 信号传导,并表明它在治疗慢性炎症性疾病方面可能具有治疗潜力。

Pivotal Advance: Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound

Maria Loiarro 1 , Federica Capolunghi, Nicola Fantò, Grazia Gallo, Silvia Campo, Brunilde Arseni, Rita Carsetti, Paolo Carminati, Rita De Santis, Vito Ruggiero, Claudio Sette Affiliations

PMID: 17548806 DOI: 10.1189/jlb.1206746 

Abstract

MyD88 is an adaptor protein, which plays an essential role in the intracellular signaling elicited by IL-1R and several TLRs. Central to its function is the ability of its Toll/IL-1R translation initiation region (TIR) domain to heterodimerize with the receptor and to homodimerize with another MyD88 molecule to favor the recruitment of downstream signaling molecules such as the serine/threonine kinases IL-1R-associated kinase 1 (IRAK1) and IRAK4. Herein, we have synthesized and tested the activity of a synthetic peptido-mimetic compound (ST2825) modeled after the structure of a heptapeptide in the BB-loop of the MyD88-TIR domain, which interferes with MyD88 signaling. ST2825 inhibited MyD88 dimerization in coimmunoprecipitation experiments. This effect was specific for homodimerization of the TIR domains and did not affect homodimerization of the death domains. Moreover, ST2825 interfered with recruitment of IRAK1 and IRAK4 by MyD88, causing inhibition of IL-1beta-mediated activation of NF-kappaB transcriptional activity. After oral administration, ST2825 dose-dependently inhibited IL-1beta-induced production of IL-6 in treated mice. Finally, we observed that ST2825 suppressed B cell proliferation and differentiation into plasma cells in response to CpG-induced activation of TLR9, a receptor that requires MyD88 for intracellular signaling. Our results indicate that ST2825 blocks IL-1R/TLR signaling by interfering with MyD88 homodimerization and suggest that it may have therapeutic potential in treatment of chronic inflammatory diseases.

16. MyD88 中间域在细胞活化和 TLR 治疗性抑制中的作用

莫妮卡·阿夫贝利 1 , 西蒙·霍瓦特 , 罗曼·杰拉拉 隶属关系

PMID: 21804016 二: 10.4049 / jimmunol.1100515 

免费文章

抽象的

适配器 MyD88 在 TLR 和 IL-1R 信号传导中起关键作用,并参与介导过度炎症。 MyD88 由一个死亡域和一个通过中间域(INT)连接的 Toll/IL-1R 域组成。 缺乏 INT 的 MyD88 的选择性剪接形式阻止通过依赖 MyD88 的 TLR 发出信号。 我们设计了一种来自 INT 的肽,并表明当与细胞穿透肽连接时,它会抑制 LPS 对 TLR4 的激活。 作为一种传递信号抑制肽的新方法,INT 肽酰化还提供了有效的细胞易位和激活抑制。 我们确定 INT 肽靶向 IL-1R 相关激酶 4。此外,MyD88 突变体和分子建模基于 Myddosome 结构改进了 MyD88-IL-1R 相关激酶 4 相互作用模型。 除 TLR4 外,INT 肽还抑制 TLR5、TLR2、TLR9 和 IL-1R 信号传导,但不抑制 TLR3,后者使用含有 Toll/IL-1R 结构域的接头诱导 IFN-β 信号接头。 通过降低 NF-κB 活化、细胞因子 mRNA 合成和下游激酶的磷酸化观察到鼠和人细胞中信号传导的抑制。 在内毒素血症小鼠模型中,INT 肽抑制炎性细胞因子的产生并提高存活率,支持 INT 肽用于抑制 MyD88 介导的炎症状况的治疗应用。 ## The role of intermediary domain of MyD88 in cell activation and therapeutic inhibition of TLRs Monika Avbelj 1 , Simon Horvat, Roman Jerala Affiliations

PMID: 21804016 DOI: 10.4049/jimmunol.1100515 

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Abstract

Adaptor MyD88 has a pivotal role in TLR and IL-1R signaling and is involved in mediating excessive inflammation. MyD88 is composed of a death domain and a Toll/IL-1R domain connected by an intermediary domain (INT). The alternatively spliced form of MyD88 lacking the INT prevents signaling through MyD88-dependent TLRs. We designed a peptide from the INT and showed that it inhibits TLR4 activation by LPS when linked to a cell-penetrating peptide. As a new approach for the delivery of signaling-inhibitory peptides, INT peptide acylation also provided efficient cell translocation and inhibition of activation. We determined that INT peptide targets IL-1R-associated kinase 4. Furthermore, MyD88 mutant and molecular modeling refines the MyD88- IL-1R-associated kinase 4 interaction model based on the Myddosome structure. In addition to TLR4, INT peptide also inhibited TLR5, TLR2, TLR9, and IL-1R signaling but not TLR3, which uses Toll/IL-1R domain-containing adapter inducing IFN-β signaling adaptor. Inhibition of signaling in murine and human cells was observed by decreased NF-κB activation, cytokine mRNA synthesis, and phosphorylation of downstream kinases. In the endotoxemic mouse model, INT peptide suppressed production of inflammatory cytokines and improved survival, supporting therapeutic application of INT peptides for the suppression of inflammatory conditions mediated by MyD88.

17 MyD88

MYD88

MYD88 可用结构|– –|– PDB |直系同源搜索: PDBe RCSB –|PDB id 代码列表 身份标识|- 别名 | MYD88 , MYD88D, 髓系分化初级反应 88, 先天免疫信号转导接头, MYD88 先天免疫信号转导接头, IMD68 外部 ID | OMIM : 602170 MGI : 108005 HomoloGene : 1849 GeneCards : MYD88 基因位置( 人类 )| 基因位置( 鼠标 )| RNA 表达 模式| 基因本体| 直向同源物|

物种 | 人类 | 鼠 –|–|– Entrez |4615|17874 Ensembl |ENSG00000172936|ENSMUSG00000032508 UniProt |Q99836|P22366 RefSeq (mRNA) |NM_010851 –|NM_001172566 –|NM_001172567 –|NM_001172568 –|NM_001172569 –|NM_002468
RefSeq (protein)|NP_034981
–|NP_001166037 –|NP_001166038 –|NP_001166039 –|NP_001166040 –|NP_002459 Location (| Chr 3: 38.14 – 38.14 | Chr 9: 119.34 – 119.34 UCSC)|Mb|Mb PubMed search [3] [4]

骨髓分化初级反应 88 (MYD88) 是一种 蛋白质 ,在人类中由 MYD88 基因编码 。 [5] [6] 内容

1 模式生物
2 功能
3 互动
4 基因多态性
5 参考文献
6 延伸阅读
7 外部链接

模式生物

模式生物 已被用于研究 MYD88 功能。 该基因最初是由 Dan Liebermann 和 Barbara Hoffman 在小鼠中发现并克隆的。 [7] 在该物种中,它是一种通用 衔接蛋白, 因为几乎所有 都使用它 TLR ( 除外 TLR 3 ) 来激活 转录因子 NF-κB 。 Mal(也称为 TIRAP )是将 Myd88 招募到 所必需的 TLR 2 和 TLR 4 ,然后 MyD88 通过 发出信号 IRAK 。 [8] 在 转基因小鼠模型中,它还与淀粉样蛋白的形成和行为在功能上相互作用 阿尔茨海默病 。 [9] Myd88 基因敲除小鼠表型

一个 的条件 敲除小鼠 名为 品系 Myd88 tm1a(EUCOMM)Wtsi [13] [14] 是作为 一部分生成的 国际敲除小鼠联盟 计划的 ——这是一个高通量诱变项目,用于生成和分发疾病的动物模型给感兴趣的科学家。 [15] [16] [17] 雄性和雌性动物进行了标准化的 表型筛选, 以确定删除的影响。 [11] [18] 对 进行了 21 项测试 纯合 突变 动物 ,揭示了一种异常:雄性突变体对 易感性增加 细菌感染的 。

功能

MYD88 基因提供了制造参与免疫细胞信号传导的蛋白质的指令。 MyD88 蛋白充当适配器,将接收来自细胞外信号的蛋白质连接到在细胞内传递信号的蛋白质。

在 先天免疫中 ,MyD88 通过 在免疫细胞激活中发挥关键作用, Toll 样受体 Toll 样受体 (TLR) 属于一大类 模式识别受体 (PRR)。 一般而言,这些受体感知由各种病原体共享的共同模式—— 共同模式 病原体相关分子模式 (PAMP),或在细胞损伤期间产生/释放的 —— 损伤相关分子模式 (DAMP)。 [19]

TLR 与 Toll 受体同源,Toll 受体首先在 的个体发育中描述 果蝇 ,负责背腹发育。 因此, TLRs 已在从昆虫到哺乳动物的所有动物中得到证实。 TLR 位于细胞表面( TLR1 、 TLR2 、 TLR4 、 TLR5 、 TLR6 )或内 体 ( TLR3 、 TLR7 、 TLR8 、 TLR9 )内,分别感知细胞外或吞噬病原体。 TLR 是完整的膜糖蛋白,具有典型的半圆形细胞外部分,其中包含负责配体结合的富含亮氨酸的重复序列,以及包含 细胞内部分 Toll-白细胞介素受体 (TIR) 结构域的 。 [20]

配体结合后,除 外的所有 TLR 都 TLR3 与接头蛋白 MyD88 相互作用。 另一种由 TLR3 和 TLR4 激活的接头蛋白称为 包含 TIR 结构域的接头诱导 IFN-β (TRIF)。 随后,这些蛋白质激活两个重要的转录因子:

NF-κB 是一种二聚体蛋白,负责表达各种炎性细胞因子、趋化因子以及粘附和共刺激分子,进而引发急性炎症和刺激适应性免疫
IRFs 是一组负责表达 I 型干扰素的蛋白质,从而设置所谓的细胞抗病毒状态。 

TLR7 和 TLR9 分别通过 MyD88 依赖性和 TRIF 非依赖性途径激活 NF-κB 和 IRF3。 [20]

人类 直系同源 MYD88 的功能似乎与小鼠相似,因为 MYD88 缺陷的人类细胞的免疫表型与 MyD88 缺陷小鼠的细胞相似。 然而,现有证据表明 MYD88 对于人类对常见病毒感染和除少数 所有抗性而言是可有可无的 化脓 性细菌感染之外的 ,这表明小鼠和人类免疫反应之间存在重大差异。 [21] MYD88 265 位突变导致亮氨酸变为脯氨酸已在许多人类淋巴瘤中被发现,包括 ABC 亚型 弥漫性大 B 细胞淋巴瘤的 [22] 和 Waldenström 巨球蛋白血症 。 [23]

交互

MyD88的已被证明 交互 搭配:

IRAK1 [24] [25] [26] [27]
IRAK2 [24] [28] [25]
白细胞介素 1 受体,I 型 [29] [28]
RAC1 [30]
TLR 4 [31] [32] [33] [24] 

基因多态性

已经鉴定了 MyD88 的各种单核苷酸多态性 (SNP)。 并且发现其中一些与对各种传染病 易感性有关 [34] 和某些自身免疫性疾病(如 溃疡性结肠炎 )的 。 [35]

原文

MYD88

Myeloid differentiation primary response 88 (MYD88) is a protein that, in humans, is encoded by the MYD88 gene.[5][6] Contents

1 Model organisms
2 Function
3 Interactions
4 Gene polymorphisms
5 References
6 Further reading
7 External links

Model organisms

Model organisms have been used in the study of MYD88 function. The gene was originally discovered and cloned by Dan Liebermann and Barbara Hoffman in mice.[7] In that species it is a universal adapter protein as it is used by almost all TLRs (except TLR 3) to activate the transcription factor NF-κB. Mal (also known as TIRAP) is necessary to recruit Myd88 to TLR 2 and TLR 4, and MyD88 then signals through IRAK.[8] It also interacts functionally with amyloid formation and behavior in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease.[9] Myd88 knockout mouse phenotype

A conditional knockout mouse line, called Myd88tm1a(EUCOMM)Wtsi[13][14] was generated as part of the International Knockout Mouse Consortium program — a high-throughput mutagenesis project to generate and distribute animal models of disease to interested scientists.[15][16][17] Male and female animals underwent a standardized phenotypic screen to determine the effects of deletion.[11][18] Twenty-one tests were carried out on homozygous mutant animals, revealing one abnormality: male mutants had an increased susceptibility to bacterial infection.

Function

The MYD88 gene provides instructions for making a protein involved in signaling within immune cells. The MyD88 protein acts as an adapter, connecting proteins that receive signals from outside the cell to the proteins that relay signals inside the cell.

In innate immunity, the MyD88 plays a pivotal role in immune cell activation through Toll-like receptors (TLR), which belong to large group of pattern recognition receptors (PRR). In general, these receptors sense common patterns which are shared by various pathogens – Pathogen-associated molecular pattern (PAMPs), or which are produced/released during cellular damage – damage-associated molecular patterns (DAMPs).[19]

TLRs are homologous to Toll receptors, which were first described in the onthogenesis of fruit flies Drosophila, being responsible for dorso-ventral development. Hence, TLRs have been proved in all animals from insects to mammals. TLRs are located either on the cellular surface (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) or within endosomes (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) sensing extracellular or phagocytosed pathogens, respectively. TLRs are integral membrane glycoproteins with typical semicircular-shaped extracellular parts containing leucine-rich repeats responsible for ligand binding, and Intracellular parts containing Toll-Interleukin receptor (TIR) domain.[20]

After ligand binding, all TLRs apart from TLR3, interact with adaptor protein MyD88. Another adaptor protein, which is activated by TLR3 and TLR4, is called TIR domain-containing adapter-inducing IFN-β (TRIF). Subsequently, these proteins activate two important transcription factors:

NF-κB is a dimeric protein responsible for expression of various inflammatory cytokines, chemokines and adhesion and costimulatory molecules, which in turn triggers acute inflammation and stimulation of adaptive immunity
IRFs is a group of proteins responsible for expression of type I interferons setting the so-called antiviral state of a cell.

TLR7 and TLR9 activate both NF-κB and IRF3 through MyD88-dependent and TRIF-independent pathway, respectively.[20]

The human ortholog MYD88 seems to function similarly to mice, since the immunological phenotype of human cells deficient in MYD88 is similar to cells from MyD88 deficient mice. However, available evidence suggests that MYD88 is dispensable for human resistance to common viral infections and to all but a few pyogenic bacterial infections, demonstrating a major difference between mouse and human immune responses.[21] Mutation in MYD88 at position 265 leading to a change from leucine to proline have been identified in many human lymphomas including ABC subtype of diffuse large B-cell lymphoma[22] and Waldenström’s macroglobulinemia.[23]

Interactions

Myd88 has been shown to interact with:

IRAK1[24][25][26][27]
IRAK2[24][28][25]
Interleukin 1 receptor, type I[29][28]
RAC1[30]
TLR 4[31][32][33][24]

Gene polymorphisms

Various single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the MyD88 have been identified. and for some of them an association with susceptibility to various infectious diseases[34] and to some autoimmune diseases like ulcerative colitis was found.[35]

References

  1. GRCh38: Ensembl release 89: ENSG00000172936 - Ensembl, May 2017
  2. GRCm38: Ensembl release 89: ENSMUSG00000032508 - Ensembl, May 2017
  3. “Human PubMed Reference:“. National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
  4. “Mouse PubMed Reference:“. National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
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18.通过与白细胞介素 1 受体相关激酶磷酸化和 MyD88 解偶联相关的 Akt 激活,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶抑制白细胞介素 1β 诱导的 NF-κB 激活

Bing-Chang Chen
吴文东
Feng-Ming Ho
Wan-Wan Lin
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开放获取 DOI: : https //doi.org/10.1074/jbc.M106014200 PlumX 指标

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶 (CaMKK) 和 Akt 是参与许多细胞反应的两种多功能激酶。 尽管 Akt 和 Ca 2+ 信号与响应某些刺激的 NF-κB 激活有关,但这些结果仍然存在争议,所涉及的机制仍然未知。 在这项研究中,我们展示了 CaMKK 和 Akt 在调节白细胞介素 1β (IL-1β) 诱导的 NF-κB 信号传导中的作用。 在人胚胎肾 293 细胞中,IL-1β 诱导 IκB 激酶 β (IKKβ) 激活、IκBα 降解、NF-κB 反式激活和弱 Akt 激活。 CaMKK 抑制剂 (KN-93) 和磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂(渥曼青霉素和 LY294002)不抑制 IL-1β 诱导的 NF-κB 活化。 然而,IL-1β 诱导的 NF-κB 活性因响应离子霉素、UTP 或毒胡萝卜素而增加的细胞内钙或通过 CaMKKc 和/或 Akt 的过表达而减弱。 离子霉素和 CaMKKc 过表达增加了 Thr 上的 Akt 磷酸化 308 和酶活性。 在这些条件下或在野生型 Akt 过表达时,IL-1β 诱导的 IKKβ 活性减弱。 此外,Akt 的显性失活突变体消除了 CaMKKc 和离子霉素对 IKKβ 的抑制,这表明 Akt 作为 CaMKK 信号传导的介质在上游靶点抑制 IL-1β 诱导的 IKK 活性。 我们还确定了 CaMKK 刺激的 Akt 和白细胞介素 1 受体相关激酶 1 (IRAK1) 之间的新相互作用,其在 IL-1β 诱导的 NF-κB 激活中起关键作用。 CaMKKc 和 Akt 过表达降低了 IRAK1 介导的 NF-κB 活性及其与 MyD88 的关联,以响应 IL-1β 刺激。 此外,CaMKKc 和 Akt 过表达增加了 Thr 处的 IRAK1 磷酸化 100 ,并且该位点的点突变消除了 Akt 对 IRAK1 介导的 NF-κB 活化的抑制作用。 总之,这些结果表明 IL-1β 信号传导的新调节机制,并表明 CaMKK 依赖性 Akt 激活通过干扰 IRAK1 与 MyD88 的偶联来抑制 IL-1β 诱导的 NF-κB 激活。

Inhibition of Interleukin-1β-induced NF-κB Activation by Calcium/Calmodulin-dependent Protein Kinase Kinase Occurs through Akt Activation Associated with Interleukin-1 Receptor-associated Kinase Phosphorylation and Uncoupling of MyD88*

Bing-Chang Chen
Wen-Tung Wu
Feng-Ming Ho
Wan-Wan Lin
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Open AccessDOI:https://doi.org/10.1074/jbc.M106014200 PlumX Metrics

Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase (CaMKK) and Akt are two multifunctional kinases involved in many cellular responses. Although Akt and Ca2+ signals have been implicated in NF-κB activation in response to certain stimuli, these results are still controversial, and the mechanism(s) involved remains unknown. In this study, we show the roles that CaMKK and Akt play in regulating interleukin-1β (IL-1β)-induced NF-κB signaling. In human embryonic kidney 293 cells, IL-1β induces IκB kinase β (IKKβ) activation, IκBα degradation, NF-κB transactivation, and weak Akt activation. A CaMKK inhibitor (KN-93) and phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors (wortmannin and LY294002) do not inhibit IL-1β-induced NF-κB activation. However, IL-1β-induced NF-κB activity is attenuated by increased intracellular calcium in response to ionomycin, UTP, or thapsigargin or by overexpression of CaMKKc and/or Akt. Ionomycin and CaMKKc overexpression increases Akt phosphorylation on Thr308 and enzyme activity. Under these conditions or upon overexpression of wild type Akt, IL-1β-induced IKKβ activity is diminished. Furthermore, a dominant negative mutant of Akt abolishes IKKβ inhibition by CaMKKc and ionomycin, suggesting that Akt acts as a mediator of CaMKK signaling to inhibit IL-1β-induced IKK activity at an upstream target site. We have also identified a novel interaction between CaMKK-stimulated Akt and interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK1), which plays a key role in IL-1β-induced NF-κB activation. CaMKKc and Akt overexpression decreases IRAK1-mediated NF-κB activity and its association with MyD88 in response to IL-1β stimulation. Furthermore, CaMKKc and Akt overexpression increases IRAK1 phosphorylation at Thr100, and point mutation of this site abrogates the inhibitory effect of Akt on IRAK1-mediated NF-κB activation. Taken together, these results indicate a novel regulatory mechanism for IL-1β signaling and suggest that CaMKK-dependent Akt activation inhibits IL-1β-induced NF-κB activation through interference with the coupling of IRAK1 to MyD88.

19.MyD88 缺乏症的化脓性细菌感染

抽象的

MyD88 是大多数 Toll 样受体 (TLR) 和白介素-1 受体 (IL-1R) 的关键下游接头。 小鼠中的 MyD88 缺乏导致在感染实验环境中对多种病原体的易感性。 我们在人类感染的自然环境中描述了一种独特的情况。 9 名常染色体隐性 MyD88 缺乏症儿童患有危及生命的、经常复发的化脓性细菌感染,包括侵袭性肺炎球菌疾病。 然而,这些患者在其他方面都很健康,对其他微生物的抵抗力正常。 他们的临床状态随着年龄的增长而改善,但不是由于 MyD88 缺乏中的任何细胞渗漏。 因此,MyD88 依赖性 TLR 和 IL-1R 对少数化脓性细菌的保护性免疫至关重要,但对于大多数自然感染的宿主防御来说是多余的。

Pyogenic Bacterial Infections in Humans with MyD88 Deficiency

Abstract

MyD88 is a key downstream adapter for most Toll-like receptors (TLRs) and interleukin-1 receptors (IL-1Rs). MyD88 deficiency in mice leads to susceptibility to a broad range of pathogens in experimental settings of infection. We describe a distinct situation in a natural setting of human infection. Nine children with autosomal recessive MyD88 deficiency suffered from life-threatening, often recurrent pyogenic bacterial infections, including invasive pneumococcal disease. However, these patients were otherwise healthy, with normal resistance to other microbes. Their clinical status improved with age, but not due to any cellular leakiness in MyD88 deficiency. The MyD88-dependent TLRs and IL-1Rs are therefore essential for protective immunity to a small number of pyogenic bacteria, but redundant for host defense to most natural infections.

20.NF-κB 的 p65 亚基对白细胞介素-1 (IL-1) 的反式激活涉及 MyD88、IL-1 受体相关激酶 1、TRAF-6 和 Rac1

卡罗琳杰弗里斯 , 1, * 安德鲁鲍伊 , 1 加雷斯布雷迪 , 1 艾玛-路易斯库克 , 2 李晓霞 , 3 和 卢克AJ奥尼尔 1 作者信息 文章注释 版权和许可信息 免责声明 本文已被 引用 PMC其他文章 。 去:

抽象的

我们已经检查了白细胞介素 1 (IL-1) 信号通路的成分在 NF-κB 的 p65 亚基对基因表达的反式激活中的参与。 用编码野生型 MyD88、IL-1 受体相关激酶 1 (IRAK-1) 和 TRAF-6 的质粒瞬时转染细胞驱动 p65 介导的反式激活。 此外,MyD88、IRAK-1 和 TRAF-6 的显性阴性形式抑制了 IL-1 诱导的反应。 在缺乏 MyD88 或 IRAK-1 的细胞中,未观察到 IL-1 的影响。 总之,这些结果表明 MyD88、IRAK-1 和 TRAF-6 是 IL-1 介导的 p65 反式激活的重要下游调节剂。 我们之前已经表明低分子量 G 蛋白 Rac1 参与了这种反应。 显性负性 MyD88 不会抑制组成性活跃的 RacV12 介导的反式激活,而显性负性 RacN17 抑制 MyD88 驱动的反应,将 Rac1 置于该途径中 MyD88 的下游。 显性负性 RacN17 抑制野生型 IRAK-1 和 TRAF-6 诱导的反式激活,反过来显性负性 IRAK-1 和 TRAF-6 抑制 RacV12 驱动的反应,表明 Rac1、IRAK-1、和 TRAF-6 调节该途径。 最后,发现 Rac1 通过与 MyD88 和 IL-1 受体辅助蛋白的相互作用与受体复合物相关联。 因此,一条源自 MyD88 并涉及 IRAK-1、TRAF-6 和 Rac1 的通路参与了 NF-κB 的 p65 亚基响应 IL-1 对基因表达的反式激活。

介绍

在促炎细胞因子白细胞介素 1 (IL-1) 刺激后,转录因子核因子 kappa B (NF-κB) 的调节通过两条独立途径的激活发生 ( 28 )。 第一个也是迄今为止表征最好的途径调节 NF-κB(通常是包含 p50 和 p65 亚基的异二聚体)从其抑制蛋白 IκB 的释放,允许 NF-κB 易位到细胞核。 最近描述的第二个途径在 NF-κB 的 p65 亚基与其共有序列结合后调节其反式激活能力 ( 3 , 17 )。

IL-1 信号转导到 IκB 降解已成为深入研究的主题 ( 21 )。 为了响应 IL-1 与其 I 型 IL-1 受体 (IL-1RI) 的结合,在 IL-1RI 与其辅助蛋白 (IL-1RAcP) 之间形成复合物。 这些蛋白质在其细胞质结构域中有一个同源区域,即 Toll/IL-1R (TIR) 结构域,这是 Toll/IL-1 样受体超家族的特征,也负责信号传导 ( 27 )。 通过同型相互作用的胞质衔接蛋白MyD88的(也含有C末端TIR结构域)相互作用,与IL-1RAcP同时涉及TIR结构域并且是IL-1的信号转导(的关键调节剂 5 , 8 , 16 )。 MyD88 与受体复合物的相互作用介导了 IL-1 受体相关激酶 (IRAK) 1 和 2 ( 的募集 9 , 26 ) 。 最近,已鉴定出一种新的蛋白质 Tollip(Toll 相互作用蛋白),它已被证明通过 Tollip 与 IL-1RAcP 的结合参与了 IRAK-1 向受体复合物的募集 ( 7 )。 一旦与受体复合物相关联,IRAK-1 随后会招募适配器肿瘤坏死因子 (TNF) 受体相关因子 6 (TRAF-6),这是 IL-1 信号传导至 NF-κB 激活的重要介质 ( 10 )。 随后 IRAK-1 的自磷酸化被认为促进了 IRAK-1 从受体复合物的解离,从而实现下游信号传导,导致 IκB 激酶 (IKK) 复合物的激活,负责 IκB 磷酸化和随后的泛素介导的降解( 12 , 40 )。 参与激活 IKK1 和 -2 的上游激酶被认为属于激酶的丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 家族。 当在细胞中过度表达时,NF-κB 相互作用激酶 (NIK) 已被证明会磷酸化和激活 IKK,并且已经表明激酶 TAK1 及其调节剂 TAB1 在 NIK 上游的作用 ( 23 )。 然而,NIK 参与调节 IKK 激活以响应 TNF 或 IL-1 最近一直存在争议 ( 2 )。 MEKK-1(MAPK/ERK 激酶-1)也被证明可以磷酸化和激活 IKKs ( 20 ),并且最近描述了一种调节 MEKK-1 的衔接蛋白 ECSIT(Toll 通路中进化保守的信号中间体)并将 TRAF-6 与 MEKK-1 法规联系起来 ( 19 )。

相比之下,关于调节 NF-κB p65 亚基反式激活活性的途径中涉及的信号成分知之甚少。 若干报告已经证明,当与任一IL-1或TNF刺激时,NF-κB的p65亚基来反式激活的基因表达的能力增强,可能是由于上的p65(多个丝氨酸残基的磷酸化的结果 3 , 4 , 17 , 36 )。 在某种程度上,已经确定了参与调节 TNF 刺激后的这种反应的激酶。 蛋白激酶 A 已被证明可磷酸化 p65 的 Rel 同源域中的丝氨酸 276,并且已显示酪蛋白激酶 II 负责磷酸化 C 端反式激活域中的丝氨酸 529 ( 37 , 38 , 41 )。 此外,报告还表明,当蛋白质在细胞质中时,IKKs 能够磷酸化反式激活结构域中丝氨酸 536 上的 p65,这为 p65 对基因表达反式激活的调节增加了另一层次的复杂性 ( 30 )。 p65 的 Rel 同源域或反式激活域的磷酸化介导 p65 与共激活因子(如 CREB ​​结合蛋白 (CBP))的相互作用。 已经证明了磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) 在导致 p65 磷酸化以响应 IL-1 的事件中的作用 ( 34 )。

尽管迅速积累了各种激酶途径在调节 p65 介导的反式激活中的作用的证据,但仍需要对调节负责磷酸化 p65 的激酶的信号事件进行大量研究。 我们实验室先前的研究已经证明低分子量 G 蛋白 Rac1 参与调节这些事件以响应 IL-1 刺激,但 Rac1 究竟如何介导该信号仍有待发现。 因此,在本研究中,我们着手评估 IL-1 信号转导的关键调节因子,即 MyD88、IRAK-1、TRAF-6 和 Rac1,在该途径中的参与。 Rac1 可以在与 IL-1RAcP 和 MyD88 的复合物中找到,位于该通路上 MyD88 的下游,需要 IRAK-1 和 TRAF-6 来影响 p65 介导的基因表达反式激活。 去:

Transactivation by the p65 Subunit of NF-κB in Response to Interleukin-1 (IL-1) Involves MyD88, IL-1 Receptor-Associated Kinase 1, TRAF-6, and Rac1

Caroline Jefferies,1,* Andrew Bowie,1 Gareth Brady,1 Emma-Louise Cooke,2 Xiaoxia Li,3 and Luke A. J. O’Neill1

Abstract

We have examined the involvement of components of the interleukin-1 (IL-1) signaling pathway in the transactivation of gene expression by the p65 subunit of NF-κB. Transient transfection of cells with plasmids encoding wild-type MyD88, IL-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK-1), and TRAF-6 drove p65-mediated transactivation. In addition, dominant negative forms of MyD88, IRAK-1, and TRAF-6 inhibited the IL-1-induced response. In cells lacking MyD88 or IRAK-1, no effect of IL-1 was observed. Together, these results indicate that MyD88, IRAK-1, and TRAF-6 are important downstream regulators of IL-1-mediated p65 transactivation. We have previously shown that the low-molecular-weight G protein Rac1 is involved in this response. Constitutively active RacV12-mediated transactivation was not inhibited by dominant negative MyD88, while dominant negative RacN17 inhibited the MyD88-driven response, placing Rac1 downstream of MyD88 on this pathway. Dominant negative RacN17 inhibited wild-type IRAK-1- and TRAF-6-induced transactivation, and in turn, dominant negative IRAK-1 and TRAF-6 inhibited the RacV12-driven response, suggesting a mutual codependence of Rac1, IRAK-1, and TRAF-6 in regulating this pathway. Finally, Rac1 was found to associate with the receptor complex via interactions with both MyD88 and the IL-1 receptor accessory protein. A pathway emanating from MyD88 and involving IRAK-1, TRAF-6, and Rac1 is therefore involved in transactivation of gene expression by the p65 subunit of NF-κB in response to IL-1.

介绍

Regulation of the transcription factor nuclear factor kappa B (NF-κB) following stimulation with the proinflammatory cytokine interleukin-1 (IL-1) occurs via activation of two independent pathways (28). The first and to date best-characterized pathway regulates the release of NF-κB (typically a heterodimer comprising the p50 and p65 subunits) from its inhibitory protein IκB, allowing NF-κB to translocate to the nucleus. The second pathway, which has recently been described, regulates the transactivating ability of the p65 subunit of NF-κB once it is bound to its consensus sequence (3, 17).

IL-1 signal transduction to IκB degradation has been the subject of intense investigation (21). In response to IL-1 binding to its type I IL-1 receptor (IL-1RI), a complex is formed between IL-1RI and its accessory protein (IL-1RAcP). These proteins have a region of homology in their cytoplasmic domains, the Toll/IL-1R (TIR) domain, which is characteristic of the Toll/IL-1-like receptor superfamily and is also responsible for signaling (27). The cytosolic adapter protein MyD88 (also containing a C-terminal TIR domain) interacts with IL-1RAcP via a homotypic interaction involving both TIR domains and is a key regulator of IL-1 signal transduction (5, 8, 16). The interaction of MyD88 with the receptor complex mediates the recruitment of the IL-1 receptor-associated kinases (IRAK) 1 and 2 (9, 26). Recently, a novel protein has been identified, Tollip (Toll-interacting protein), which has been shown to be involved in IRAK-1 recruitment to the receptor complex via association of Tollip with IL-1RAcP (7). Once associated with the receptor complex, IRAK-1 subsequently recruits the adapter tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 6 (TRAF-6), an essential mediator of IL-1 signaling to NF-κB activation (10). Subsequent autophosphorylation of IRAK-1 is thought to promote dissociation of IRAK-1 from the receptor complex, thus enabling downstream signaling, resulting in activation of the IκB kinase (IKK) complex, responsible for IκB phosphorylation and subsequent ubiquitin-mediated degradation (12, 40). The upstream kinases involved in activating IKK1 and -2 are thought to belong to the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family of kinases. NF-κB-interacting kinase (NIK) has been shown to phosphorylate and activate the IKKs when overexpressed in cells, and a role for the kinase TAK1 and its regulator TAB1, upstream of NIK, has been indicated (23). However, the involvement of NIK in regulating IKK activation in response to either TNF or IL-1 has recently been disputed (2). MEKK-1 (MAPK/ERK kinase-1) has also been shown to phosphorylate and activate the IKKs (20), and recently an adapter protein, ECSIT (evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathways), has been described which regulates MEKK-1 and links TRAF-6 with MEKK-1 regulation (19).

In contrast, little is known about the signaling components involved in the pathway regulating the transactivating activity of the p65 subunit of NF-κB. Several reports have demonstrated that upon stimulation with either IL-1 or TNF, the ability of the p65 subunit of NF-κB to transactivate gene expression is enhanced, possibly as a result of phosphorylation of multiple serine residues on p65 (3, 4, 17, 36). The kinases involved in regulating this response following TNF stimulation have, to some extent, been identified. Protein kinase A has been demonstrated to phosphorylate serine 276 in the Rel homology domain of p65, and casein kinase II has been shown to be responsible for phosphorylating serine 529 in the C-terminal transactivation domain (37, 38, 41). In addition, reports have also indicated the ability of the IKKs to phosphorylate p65 on serine 536 in the transactivation domain while the protein is in the cytoplasm, adding another level of complexity to the regulation of transactivation of gene expression by p65 (30). Phosphorylation of either the Rel homology domain or the transactivation domain of p65 mediates the interaction of p65 with coactivators such as CREB-binding protein (CBP). A role for phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) in the events leading to phosphorylation of p65 in response to IL-1 has been demonstrated (34).

Despite the rapidly accumulating evidence for a role of various kinase pathways in regulating p65-mediated transactivation, much research is required into the signaling events regulating the kinases responsible for phosphorylating p65. Previous studies in our laboratory have demonstrated the involvement of the low-molecular-weight G protein Rac1 in regulating these events in response to IL-1 stimulation, but exactly how Rac1 mediates this signal remains to be discovered. In this study we have therefore set out to assess the involvement of key regulators of IL-1 signal transduction, namely, MyD88, IRAK-1, TRAF-6, and Rac1, in this pathway. Rac1 can be found in a complex with both IL-1RAcP and MyD88, lying downstream of MyD88 on the pathway and requiring IRAK-1 and TRAF-6 for its effect on p65-mediated transactivation of gene expression.